哺乳动物细胞裂解物中 GFP 融合蛋白的免疫沉淀 (IP/CoIP) 方案
哺乳动物细胞裂解物中 GFP 融合蛋白的免疫沉淀 (IP/CoIP) 方案
该方案旨在对 GFP 标记的融合蛋白进行免疫沉淀，以通过蛋白质免疫印迹或活性测定进行分析。
溶液和试剂
1X 细胞裂解缓冲液：50 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100。建议在使用前添加 1 mM PMSF。
1X 洗涤缓冲液：TBS（50 mM Tris HCl，150 mM NaCl，pH 7.5）
5X SDS 上样缓冲液
1. 准备细胞裂解物
1. 要在非变性条件下收获细胞，去除培养基并用冰冷的 PBS 冲洗细胞一次。去除 PBS 并向每个板（10 cm，106-107 个细胞）中加入 0.5 mL-1mL 1X 冰冷细胞裂解缓冲液（添加蛋白酶抑制剂混合物和 PMSF），并将板在冰上孵育 30-40 分钟，4 °旋转摄氏度。
2. 从平板上刮下裂解的细胞并转移到微量离心管中。继续冰上。
3. 在冰上对样品进行超声处理 3 次，每次 5 秒（可选步骤）。
4. 4°C、14,000 xg 微量离心 10 分钟，将上清液转移到新管中。如有必要，可将裂解物储存在 –80°C 下。
注意：如果目的蛋白是核蛋白，请使用RIPA裂解液裂解细胞，并加入PIC、1mM PMSF、2.5mM Mgcl2和1mg/ml DNase I。
2. 平衡珠子
1. 颠倒产品管或轻轻上下吹打以重悬珠子。不要涡旋珠子。
2. 吸取 25 µL 珠浆到 EP 管（1.5 mL）中，然后加入 1 mL 冰冷的洗涤缓冲液。用手轻轻摇晃 1-2 分钟。不要涡旋珠子。
3、磁选60秒。
4. 弃去上清，重复洗涤 3 次。
3. 免疫沉淀
1. 取 500 μL 细胞裂解液，加入 25 μL 抗体偶联磁珠悬液，4°C 孵育 1-3 小时或 4°C 过夜。
4. 清洗蛋白质-纳米抗体-珠复合体
注意：如果研究了 Co-IP 相互作用的蛋白质，请减少洗涤次数，并降低洗涤缓冲液的离子强度。
加入 1.0 mL 的 Wash Buffer 并悬浮珠子复合物，磁选，然后弃去上清液。重复上述步骤至少四次。
5. 下游分析的洗脱
GFP 融合蛋白的洗脱-根据蛋白质特性或进一步用途推荐两种洗脱方法：
选项 A：天然洗脱
在酸性条件下用 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5) 洗脱。这是一种快速有效的洗脱方法。用中和缓冲液（1 M Tris，pH 10.4）中和洗脱的蛋白质可能有助于保持其活性。中和缓冲液需要预先放入收集管中。
注意：需提前做初步实验，确定中和甘氨酸（PH 2.5）需要多少中和缓冲液
选项 B：SDS-PAGE 的变性洗脱
在凝胶电泳和免疫印迹的变性条件下用样品上样缓冲液洗脱。
A：用 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5) 洗脱 – 该过程应在室温下进行。
注意：不要将珠子留在该缓冲液中超过 20 分钟。
注意：不要将珠子留在该缓冲液中超过 20 分钟。
1. 向每个样品和对照珠复合物中加入 50 µL 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5)。
2. 在 4°C 下轻轻摇动或在旋转器上孵育样品和对照 5-10 分钟。
3. 将试管放入磁力分离器中以收集珠子。将上清液转移到含有 25-35 μL 中和缓冲液的新管中。小心不要转移任何珠子。
4. 重复步骤 1-3 以提高洗脱效率，将洗脱液集中在同一管中或通过不同管收集洗脱液。
6. 如需立即使用，请将洗脱液储存在 2-8 °C。储存在 –20 °C 以进行长期储存。
B：用 SDS-PAGE 上样缓冲液洗脱
1. 用 30 µL 1X SDS 样品上样缓冲液重悬每个样品（6 µL 5X SDS 样品上样缓冲液可以添加到 24 µL 细胞裂解缓冲液中）。涡流。
2. 在 95 – 100°C 下将样品管和对照管煮沸 10 分钟。
3. 将试管放入磁力分离器中以收集珠子。将上清液转移到新管中。样品和对照已准备好加载到 SDS-PAGE 上，并使用抗 GFP 或针对融合蛋白的特异性抗体进行免疫印迹。