Cell Meter  PE-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测细胞凋亡的试剂盒，膜联蛋白V可以与包括PE的荧光染料结合。该染料保留了其对磷脂酰丝氨酸（PS）的高亲和力，因此可用作流式细胞术分析正在经历细胞凋亡的细胞的敏感探针。由于PS的外化发生在细胞凋亡的早期阶段，PE膜联蛋白V染色可以比基于核变化（例如DNA片段化）的测定更早地鉴定细胞凋亡。 PE膜联蛋白V染色先于膜完整性的丧失，膜完整性伴随由凋亡或坏死过程导致的最新细胞死亡阶段。因此，用PE膜联蛋白V染色通常与碘化丙啶（PI）或7-氨基 – 放线菌素（7-AAD）等活体染料结合使用，使研究者能够鉴别早期凋亡细胞（7-AAD阴性，PE膜联蛋白V阳性）。具有完整膜的存活细胞排除7-AAD，而死亡和受损细胞的膜可透过7-AAD。例如，被认为存活的细胞既是PE膜联蛋白V也是7-AAD阴性的，而处于早期凋亡的细胞是PE膜联蛋白V阳性和7-AAD阴性，而处于晚期凋亡或已经死亡的细胞都是PE膜联蛋白V和7-AAD阳性。该测定法不区分经历凋亡性死亡的细胞与因坏死性通路而死亡的细胞，因为在任一情况下，死亡细胞都将用PE膜联蛋白V和7-AAD染色。然而，当随着时间测量细胞凋亡时，可以经常从PE膜联蛋白V和7-AAD阴性（可行的，或不可测量的细胞凋亡）追踪细胞至PE膜联蛋白V阳性和7-AAD阴性（早期凋亡，膜完整性存在），最后是PE膜联蛋白V和7-AAD阳性（末期凋亡和死亡）。细胞通过这三个阶段的运动表明细胞凋亡。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Cell Meter  PE-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒。 

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适用仪器

样品实验方案

简要概述

1.用测试化合物（200μL/样品）制备细胞
2.添加RPE-膜联蛋白V测定溶液
3.在室温下孵育20-60分钟
4.使用FL2通道（Ex / Em = 488/585 nm）用流式细胞仪分析细胞

储备溶液配制

        除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1. RPE-Annexin V原液（100X）：
将含有0.2％BSA的200μLPBS加入到RPE-膜联蛋白V（组分A）的小瓶中以制备100X RPE-膜联蛋白V储备溶液。 注意：将重构的100X RPE-Annexin V储备溶液储存在4°C。有关细胞样品制备的指南，点击查看。

操作步骤

1.用测试化合物处理细胞一段所需的时间（用星形孢菌素处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。注意：膜粘附细胞的膜联蛋白V流式细胞术分析未经常检测，因为在细胞分离或收获期间可能发生特定的膜损伤。然而，Casiola-Rosen等人先前报道了利用膜联蛋白V对贴壁细胞类型进行流式细胞术的方法。

2.离心细胞，得到1-5×10⁵个细胞/管。

3.将细胞重悬于200μL测定缓冲液（组分B）中。

4.向细胞中加入2μL100XRPE-膜联蛋白V原液。

5.可选：为坏死细胞添加2μL100XNuclear Red DCS（成分C）。

6.在室温下孵育20至60分钟，避光。

7.可选：在使用流式细胞仪分析细胞之前，添加200至300μL的测定缓冲液（组分B）以增加体积。

8.使用具有FL2通道的流式细胞仪（Ex / Em = 488 / 585nm）监测RPE-膜联蛋白V的荧光强度。当将Nuclear Red DCS添加到细胞中时，使用FL4通道测量细胞活力。

数据分析

        在活的非凋亡细胞中，RPE-膜联蛋白V检测非诱导细胞中的先天性细胞凋亡，其通常为所有细胞的2-6％。 在凋亡细胞中，RPE-膜联蛋白V与磷脂酰丝氨酸结合，磷脂酰丝氨酸位于细胞膜的外叶上，因此导致染色强度增加。

参考文献

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