T4 DNA Ligase催化双链DNA或RNA中毗邻的5′-磷酸基团和3′-羟基末端之间形成磷酸二酯键。酶还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA复合体中的单链切口，连接DNA的粘性和平末端，但是该酶对单链核酸无酶活性。

T4 DNA Ligase需要辅因子ATP。
 

特点

• 快速–室温下10分钟内完成粘末端的连接反应。
• 该酶在 Scientific限制性内切酶、PCR和RT缓冲液(添加ATP)中有活性。
• 配套提供聚乙二醇溶液，以高效进行平末端连接。

 

应用

• 克隆酶切产生的DNA片段。
• 克隆PCR产物。
• 连接双链寡聚核苷酸街头或连接物。
• 定点诱变。
• 扩增片段长度多态性 (AFLP)。
• 连接酶介导的 RNA 检测。
• 双链DNA，RNA 或 DNA/RNA 复合体中缺口的修复。
• 线性DNA自身环化。

 

浓度

1 Weiss u/µl = 200 CEU*/µl
5 Weiss u/µl = 1000 CEU*/µl
30 Weiss u/µl = 6000 CEU*/µl
* 一个粘性末端连接单位的是指在16°C 、30分钟内50%连接HindIII酶切的lamda DNA产物所需要的酶的量。

 

来源

含有T4噬菌体克隆基因30的大肠杆菌。

 

分子量

55.3 kDa，单体。

 

活性单位定义

1个活性单位是指在ATP-PPi交换反应中，37°C、20分钟内将1nmol [³²PPi]转换为Norit可吸收形式所需的酶量。1个Weiss单位相当于约200个粘性末端连接单位。

酶活性分析混合物：66 mM Tris-HCl (pH 7.6), 6.6 mM MgCl₂, 0.066 mM ATP, 10 mM DTT, 3.3 micro Mol [³²PP_i]

 

保存缓冲液

保存缓冲液组分：
20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA和50% (v/v)甘油。

 

10X T4 DNA Ligase 缓冲液(#B69)

400 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl₂, 100 mM DTT, 5 mM ATP (pH 7.8, 25°C)。

 

质量控制

相关测试表明无内切和外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、磷酸酶污染。 功能检测：粘性末端或平末端DNA的连接能力。

 

抑制与失活

• 抑制剂：当反应体系中NaCl或KCl的浓度超过200��mM时，可强烈抑制T4 DNA Ligase活性。
• 失活：65°C加热10分钟或者70°C加热5分钟。

 

备注

• 聚乙二醇(PEG) 极大地增加平末端连接效率 (5) 。反应体系中的PEG 4000的建议浓度为5% (w/v)。
• T4 DNA Ligase与DNA结合会改变条带的琼脂糖凝胶电泳迁移率。为避免此现象，电泳前需处理样本或分子量标准。样本处理方法如下：样本或分子量标准与Fermentas公司6X DNA Loading Dye & SDS溶液(#R1151)混合；70°C加热5分钟或65°C加热10分钟后冰浴保存。
• 转化时，连接产物的体积不能超过感受态细胞体积的10%。
• 电转化之前，先用氯仿抽提方法除去连接混合物中的T4 DNA Ligase。然后经乙醇沉淀纯化抽提产物。

订购信息：

货号	产品名称	规格
EL0014	T4 DNA Ligase (5 Weiss U/µL)	200 U
EL0011	T4 DNA Ligase (5 Weiss U/µL)	1,000 U
EL0012	T4 DNA Ligase (5 Weiss U/µL)	5 x 1,000 U
EL0013	T4 DNA Ligase, HC (30 U/µL)	5000 U
EL0016	T4 DNA Ligase, LC (1 U/µL)	2×500 U

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