使用点击化学测定细胞增殖和 DNA 复制

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使用点击化学测定细胞增殖和 DNA 复制

细胞增殖测定广泛应用于细胞毒性研究、癌症研究和细胞生物学的许多其他领域。其中许多可以通过荧光标记对增殖细胞进行可视化，并且适合高通量筛选。

检测复制的 DNA 可以说是检测增殖的最直接方法。这是通过使用溴脱氧尿苷 (BrdU)核苷实现的，该核苷在复制过程中融入 DNA。然后，细胞 DNA 中的这些核苷修饰可以通过抗 BrdU 抗体检测到。尽管具有特异性，但这种测定方法繁琐且难以重现，因为需要用刺激性试剂处理细胞，以使 DNA 暴露于抗体，否则这些抗体不会穿透细胞结构。

一种更温和的替代方案是乙炔基脱氧尿苷 (EdU)，可以通过将其添加到培养基中或注射到动物体内来将其递送至细胞。掺入 DNA 后，该核苷可在铜 (I) 催化下与各种荧光染料叠氮化物结合，从而对复制的 DNA 进行荧光染色。该测定易于执行、快速且可重复。它不需要对细胞进行严酷的处理（只需要用 Triton 进行透化），因此可以更好地保存细胞结构。在用叠氮化染料处理和最后的洗涤步骤（步骤 8）后，可以使用具有各种发射波长的荧光团（例如 Hoechst、DAPI或荧光标记抗体）来标记细胞。

所需试剂

  • 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (EdU)

  • 铜 (II)-BTTAA 络合物— сlick сhemistry 催化剂

  • 抗坏血酸— 铜的还原剂

  • 叠氮化物荧光染料

  • DMSO，标签级— 叠氮化物溶剂

  • Triton X-100（或 Tween-20）

  • PBS，pH 7.4

  • 100 mM Tris 缓冲液，pH 7.4

协议

确切的方案取决于特定的细胞或组织类型，但一般工作流程如下所述：

  1. 将细胞/组织与 10–20 μM EdU 孵育所需的时间。

  2. 用含 3.7% 甲醛的 PBS 固定细胞 15 分钟。

  3. 用 PBS 清洗细胞。

  4. 用含有 0.2% Triton X-100（或 0.5% Tween-20）的 PBS 透化细胞 30 分钟。

  5. 再次用 PBS 清洗细胞。

  6. 在 100 mM Tris 缓冲液，pH 7.4（对于磺化叠氮化物）或 100 mM Tris 缓冲液，pH 7.4（含 50% DMSO）中制备含有 2 mM 铜 (II)-BTTAA 复合物、10 mM 抗坏血酸和 5 μM 叠氮化染料的混合物（对于非磺化叠氮化物）。该混合物应新鲜制备，因为铜 (I) 在水溶液中不稳定。

  7. 将细胞与点击反应混合物一起孵育 30 分钟。

  8. 用 PBS 清洗细胞。

  9. （可选）如果细胞必须用不同的荧光团标记，请使用标准方案继续染色。

磺化（水溶性）叠氮化物，例如磺基氰叠氮化物和 AF 叠氮化物，可产生最佳效果。当使用非磺化叠氮化物（例如氰叠氮化物或 BDP 叠氮化物）时，确保反应混合物中 DMSO 浓度为 50%。