使用 PROTRAP 进行自上而下的样品制备

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使用 PROTRAP 进行自上而下的样品制备

准备注意事项
ProTrap XG 设备经过优化，可处理 50 μg 蛋白质。
对于可重现和最大的蛋白质沉淀，沉淀过程中样品中的最大SDS含量应为1%。如果您的提取或裂解缓冲液含有超过 1% SDS，请使用最大离子强度为 300 mM 的缓冲液稀释。
离心速度基于带 24 x 1.5/2.0 mL 转子的标准台式微量离心机。
提供的时间仅供参考。
如果过滤滤芯中残留的液体超过几微升，请将其返回到离心机并重复旋转，或考虑提高旋转速度。建议在后续旋转中使用 3000 ×g （6000 rpm），ProTrap XG 已经过高达 9000 ×g （10，000 rpm） 的测试。

所需材料
所有化学品和试剂应为ACS级/HPLC级或更高。
丙酮
5 M 氯化钠水溶液
80%甲酸水溶液（冷却至–20°C）
冷冻水

自上而下的样品制备方案

对于可重现和最大的蛋白质沉淀，沉淀过程中样品中的最大SDS含量应为1%。如果您的提取或裂解缓冲液含有超过 1% SDS，请使用最大离子强度为 300 mM 的缓冲液稀释。 为获得最佳体验，样品应至少含有 50 mM NaCl。 如果需要添加氯化钠，请使用 5 M 氯化钠溶液。

  • 不要让过滤滤芯中的膜在步骤之间变干。

  • 将塞子拧到滤芯的底座上。 

  • 将 100 μL 稀释的样品蛋白转移到堵塞的过滤柱中。

  • 加入 400 μL 室温丙酮。

  • 盖上过滤滤芯并轻轻摇晃，倾斜不超过 45°，以混合溶剂。 

  • 将过滤柱插入微量离心管中，等待 30 分钟，使蛋白质在室温下聚集。

  • 连接塞子后，以 2500 × g （5000 rpm） 离心×2 分钟。

  • 从微量离心管中取出过滤盒，倒置并拧下塞子。

  • 将带盖的过滤柱放回微量离心管中，并以 500 × （2000 rpm） 离心×3 分钟。 丢弃通过溶剂的流量。 如果过滤滤芯中残留任何溶剂，请以 3000 ×g （6000 rpm） 的速度重新旋转装置 2-5 分钟。

  • 用 400 μL 丙酮清洗蛋白质颗粒。立即以 500 × g (2000 rpm) × 2 分钟离心。丢弃流过洗涤溶剂的流。

  • 更换插头。在 –20°C 下将过滤筒中的沉淀物冷却 10 分钟。

  • 在水中加入 50 µL 冷 (-20°C) 80% 甲酸。盖上滤芯，放入冰箱 10 分钟，然后超声处理 1 分钟。

  • 加入 450 µL 冷冻水；盖并涡旋以混合溶剂。

  • 完整的蛋白质可以在干净的微量离心管中直接回收，以 350 × g (2000 rpm) × 5 分钟的速度离心。

如果需要进一步的蛋白质净化，再溶解的蛋白质也可以使用提供的可选 SPE 小柱和 SPE蛋白质/肽净化方案进行 SPE 。