什么是荧光探针？

荧光是光致发光的一种发光现象。当某些物质受到光、电、磁、化学能激发时，电子吸收能量并从基态跃迁到激发态，激发态的电子不稳定。它将通过辐射跃迁和非辐射跃迁回到基态。辐射跃迁的衰变过程伴随着光子的发射，产生荧光和磷光。非辐射跃迁包括振动弛豫、内部转换和系间跨越。非辐射跃迁会造成能量损失，发射光子的能量一般小于吸收光子的能量。因此，荧光物质的发射光谱波长通常大于吸收光谱波长。

一 荧光探针需要满足的条件

1.易于合成和纯化，收率高，安全无毒。

2.稳定性和溶解性好，特别是脂溶性透膜性好。

3、通过物理化学作用与标记物质特异性结合，标记条件温和。残留物和副产物很容易去除。

4.荧光量子产率高，摩尔消光系数大，抗漂白能力强。荧光与背景形成鲜明对比。此外。激发和发射波长可以有效避免细胞自发荧光的背景干扰。

二 近红外（NIR）荧光探头的优点

1、近红外光检测样品穿透力强、成像分辨率高、检测灵敏度高、信噪比高。

2.在可见光区域，生物组织的某些成分会自激发产生自发荧光。并且样品的散射光强度较高，严重干扰荧光检测和成像追踪。近红外荧光自发荧光背景低。

三 检测细胞内活性小分子（RSM）的NIR方法

细胞中的RSM往往寿命短、反应活性高、浓度极低、对环境敏感且不发出荧光。因此，必须借助荧光探针的特异性捕获标记才能具有近红外荧光特性。

四 荧光探针广泛应用于生物大分子研究的原因

分子荧光探针广泛用于研究蛋白质和其他生物大分子接触表面的表面诱导构象变化。在直接分析方法中，荧光分析方法应用广泛，且优于间接分析方法，因为它不破坏结合平衡，接近反应的真实存在。

五荧光探针作为光敏剂药物的能量供体

荧光纳米探针不仅可以作为药物载体与光敏药物分子结合形成多功能纳米材料，还可以作为光敏药物分子的能量供体，提高其单线态氧产生效率。

光敏剂和荧光染料的吸收光谱、荧光发射光谱重叠较少。有效避免分子间能量转移引起的荧光猝灭、单线态氧生成效率降低、荧光成像等。在荧光成像的同时，光敏剂强制激发产生的单线态氧也可能与激发态发生光化学反应。荧光探针并引起荧光猝灭。或者它可能会暴露量子点在成像过程中潜在的毒副作用。因此，设计合适的纳米载体结构将光敏剂药物分子与荧光探针物理隔离是避免此类光化学反应的有效方法。

六、荧光分子探针的组成及功能

1.受体

它选择性地与物体（分析物）结合并引起探针所在的化学或生物微环境的变化。

2.荧光团

识别基团与分析物结合而引起的化学或生物微环境变化，转化为仪器易于感知（颜色变化）或可检测的信号。

小分子荧光探针一般采用有机小分子荧光团，包括蒽、香dou素、荧光素、BODIPY、萘二甲酰亚胺、罗丹明、花青等。其衍生物的发射波长范围几乎覆盖所有可见光区域（400-800 nm）。并且通过对这些荧光团进行适当修饰，可以实现蓝、绿光到红光和近红外光（650-900 nm）的覆盖。此外，发光量子点、上转换纳米材料、高分子聚合物荧光材料、荧光蛋白等也可作为荧光探针中的信号基团。

3.垫片

连接荧光基团和识别基团，有效地将识别信息转化为荧光信号，如荧光强度的变化、荧光光谱的移动、荧光寿命的变化等。从而实现对治疗检测对象的有效检测。并非所有探针都有连接基团。

七 荧光探针可检测生物体物质

1.质子(H+)。

2.自由基和其他活性氮和氧物种（ROS、RNS）。

3.气体信号分子（NO、CO、H2S……）

4.重金属污染（Cd2+.Hg2+.Pb2+…）

5.阴离子(Cl-, HCO3-, H2PO4-, HPO42-…)

6.过渡金属离子(Fe2+/Fe3+, Zn2+, Cu+/Cu2+…)

7.碱金属和碱土金属离子（K+、Na+、Ca2+、Mg2+…）

8.DNA、RNA、蛋白质等生物大分子。

9、有机小分子如肽、葡萄糖、麦芽糖等。

八、荧光探针的种类

根据与客体相互作用后荧光信号的变化，可分为强度变化型荧光探针和比例计型荧光探针。强度变化型荧光探针分为猝灭型（ON-OFF）和增强型（OFF-ON）荧光探针。

强度变化型荧光探针根据荧光强度的变化实现客体物种的检测。由于荧光强度还受到探针浓度、激发光源效率、探针所处环境等因素的影响，此类探针在客体物种的定量检测中也存在明显的局限性。目前，大多数荧光探针都是增强型荧光探针。

比率荧光探针本身也发射一定波长的荧光。其明显的优点是可以通过两个波长下荧光强度的比值来消除大部分环境因素的干扰，从而实现在探针浓度未知的情况下对被测物种的定量检测。

九 荧光探针的设计机理

传统的分子探针设计原理包括光诱导电子转移（PET）、分子内电荷转移（ICT）、扭曲分子内电荷转移（TICT）、金属配体电荷转移（MLCT）、电子能量转移（EET）、荧光共振能量转移（FRET） ）、激发态分子内质子转移（ESIPT）、激发态准分子/激基复合物形成等。新兴机制包括聚集诱导发射（AIE）、上转换发光（UCL）等。

十 光电子转移（PET）

一般来说，光致电子转移（PET）工艺分为两种类型。一种是电子从电子供体转移到激发态荧光团（电子受体），激发态荧光团被还原而引起荧光猝灭。另一种是电子从激发态荧光团（电子供体）转移到激发态荧光团（电子受体）。电子受体、激发态荧光团被氧化导致荧光猝灭。当物体未结合时，荧光团和受体之间的 PET 将淬灭荧光。物体结合后，PET 过程受到抑制，荧光团发出荧光。

十一、分子内电荷转移（ICT）

分子内电荷转移也称为光诱导电荷转移（PCT），也是设计比例荧光探针的重要方法。这类荧光探针的识别基团直接与荧光团相连，也可以理解为组成荧光团的某些原子或基团直接参与客体的识别。

十二 荧光共振能量转移（FRET）

荧光共振能量转移（FRET）是能量转移（ET）的一种。能量转移是指分子中能量从供体发色团向受体发色团转移的过程。 FRET 效率通常通过调整光谱重叠程度和供体-受体距离来改变。

十三激发分子内质子转移（ESIPT）

ESIPT现象是指化合物分子从基态跃迁到激发态，然后质子通过分子内氢键转移到分子中相邻的N、S、O杂原子上，形成相应互变异构体的过程。

十四准分子/激基复合物形成

准分子（Er）可以定义为由相同结构的激发荧光团和基态荧光团相互作用形成的缔合体。同样，如果处于激发态的荧光团和处于基态的具有不同结构的荧光团形成复合物，则称为激发态复合物。