冷冻干燥是将需要干燥的药液预先冷冻成固体的干燥方法。并在低温低压条件下直接升华以除去冷冻状态的水，而不需要经过液态。由于整个操作过程处于低温状态，因此该方法特别适用于热敏性蛋白药物制剂的制备。冻干后的蛋白药物呈松散状，不仅有利于保存，而且有利于蛋白药物复溶后的复性。

显然，冻干技术为理化性质不稳定的蛋白质药物的制备提供了有效的方法。然而，冻干过程是一个复杂的相变过程。药物在冷冻、冻融、干燥、储存过程中引起蛋白质变性的因素有很多。因此往往需要使用一些保护剂来稳定处方中的蛋白质。冷冻保护剂种类繁多，作用机制也复杂。本文将对蛋白质冻干产品的保护剂进行综述。

在冻干制品的整个生产过程中，存在着多种应力，包括低温应力、冷冻应力、干燥应力等。这些应激往往是直接或间接导致蛋白药物不稳定的因素。根据抗应激保护剂的不同，蛋白质保护剂初步分为冷冻保护剂和冻干保护剂。优秀的蛋白质保护剂不仅可以在整个冻干过程中保护蛋白质药物，而且可以抑制蛋白质药物在成品储存期间的变性。由于蛋白质药物在储存过程中的变性速率往往大于冷冻干燥过程中的变性速率，大多数在溶液中有效的蛋白质冷冻保护剂对干燥蛋白质没有保护作用，甚至会加速蛋白质药物的不稳定比例。

为了扩大保护作用，需要在冻干产品中使用两种以上的保护剂，如多羟基化合物、糖、蛋白质、聚合物、氨基酸、盐、胺、表面活性剂等。

1.多羟基化合物

多羟基化合物长期以来被用作蛋白质的防冻剂。常见的冻干保护剂有甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇、硫醇、聚乙二醇等。甘油可以促进冻干过氧化氢酶的复性。而当甘油浓度升至0.8%时，过氧化氢酶即可全复性。在某些处方中，甘露醇可以作为蛋白质的冻干保护剂。甘露醇对蛋白质的保护作用与其浓度、形态、结构有关，其浓度有时与晶体形态有关。一般认为，无定形甘露醇具有稳定蛋白质的作用，而结晶甘露醇则失去保护功能。1%或更低浓度的甘露醇通过形成无定形结构阻止蛋白质药物的聚集，但高浓度的甘露醇容易形成结晶态促进蛋白质药物的聚集。

2.糖

糖是最常见和广泛使用的冻干保护剂类型。它是蛋白质的非特异性稳定剂，在冻干的各个阶段都能对蛋白质药物起到一定的保护作用。糖的保护作用与其类型有关，蛋白质和双糖是研究最多也有效的保护剂，其中蔗糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖组成的二糖，化学性质稳定，结构无定形。对于阻断蛋白质二级结构的变化，冷冻干燥过程和延长储存期间蛋白质的延伸和聚集发挥着重要作用。

与蔗糖相比，海藻糖的玻璃化转变温度较高，吸湿性较低，无还原性。这些优点都表明海藻糖可能具有更广阔的应用前景。与小分子糖相比，大分子糖似乎对蛋白质提供的保护较少。许多研究表明，高分子量的多糖并不是冻干保护剂的选择。

但一些研究却显示出相反的结果，如大分子量菊粉研究表明，聚合度为5.5-6.0的菊粉对碱性磷酸酶的保护作用明显高于海藻糖和低聚合度的菊粉。这说明多糖的保护作用不能一概而论。

特别是在储存期间，右旋糖酐或多糖可以提高产品的玻璃化转变温度，防止蛋白质因产品崩解而被破坏。葡萄糖在冻干过程中可以部分保持无定形形式，这对某些蛋白质药物有一定的保护作用，但需要注意的是，应谨慎选择以葡萄糖为基础的还原糖作为蛋白质保护剂。糖对蛋白质的保护作用有时取决于其浓度。

通常，糖的保护作用在一定浓度范围内随着浓度的增加而增强。当达到一定浓度时，保护作用达到最大值，然后增加糖的浓度，保护作用不再明显增加，有时反而会降低。关于糖发挥最大保护作用时的浓度有不同的报道。

例如，100mmol/L蔗糖对B-半乳糖酶具有最佳保护作用，而对磷酸果糖激酶提供最大保护作用的海藻糖浓度为300mg/ml。已报道的可实现最大稳定的低糖浓度是足够的在蛋白质表面形成单分子层。

事实上，糖对蛋白质的保护作用不仅取决于糖的总体浓度，还取决于两者的比例。有研究发现，当α-D-吡喃甘露糖、乳糖、海藻糖、纤维二糖与重组人生长激素的摩尔比为131:1时，它们都能100%占据重组人生长激素上的强水结合位点和弱水结合位点，提供最佳保护效果。当摩尔比达到300:1和1000:1时，糖对重组人生长激素的保护作用不再增加，并且在某些处方中保护作用会降低。

糖的还原特性和其他特性也会影响其对蛋白质的保护作用。葡萄糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖和其他还原糖可与蛋白质中暴露的某些氨基酸残基发生麦拉德反应（氨或棕色反应）。会使产品变黄并降低蛋白质活性。不同旋光度的麦芽糖糊精在冻干过程中对乳酸脱氢酶的保护作用表现出很大差异。

目前用作蛋白质保护剂的糖包括葡萄糖、α-D-吡喃甘露糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、纤维二糖、甘露糖、麦芽糖、肌醇、白糖、菊粉、葡聚糖、麦芽糖糊精、麦亚多糖、肝素、2-羟丙基-B环糊精和很快。虽然糖可以为大多数蛋白质提供可靠的保护，但并不是所有的蛋白质都能受到糖的保护，这仍需要更细致和深入的研究。

3.氨基酸

氨基酸是常见的蛋白质保护剂之一。在冷冻过程中，低浓度的甘氨酸可以通过抑制10或100mmol/L磷酸缓冲盐结晶引起的pH值变化来防止蛋白质药物的变性。无定形形式的甘氨酸可以防止重组人生长激素在冷冻干燥过程中聚集。结晶甘氨酸可提高成品的崩解温度，防止崩解引起的蛋白质药物的破坏。常用的氨基酸蛋白保护剂有脯氨酸、色氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、盐酸赖氨酸、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等。

4.聚合物

聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、明胶、聚乙烯亚胺和其他聚合物也常用作蛋白质的冷冻保护剂。一般来说，聚合物的稳定效果取决于聚合物的多种性能。不同聚合度和浓度的聚合物提供不同的保护。例如，聚合度高的PVP具有较高的玻璃化转变温度。随着PVP浓度和分子量的增加，水溶液的粘度会增加，蔗糖的玻璃化转变温度会显着升高，这也增加了冷冻过程中对蛋白质的保护。

但聚合度太大时，聚合物会在冷冻过程中结晶，失去对蛋白质的保护作用。过高的浓度和分子量会增加最终产品的水分，使产品中的蛋白质更加不稳定。右旋糖酐40对猪胰蛋白酶的稳定作用比右旋糖酐80更强，表明适当的聚合物链长有利于胰蛋白酶的稳定性。

5.蛋白质

蛋白质保护剂可分为两类：一类是蛋白质药物，另一类是外来蛋白质。一些蛋白质冻融后的活性与蛋白质的初始浓度直接相关。初始浓度的增加有时会促进蛋白质的复性。

常用的外来蛋白质保护剂是血清白蛋白，它是一种经典且优异的蛋白质稳定剂。例如，1%牛血清白蛋白可以防止兔肌肉乳酸脱氢酶水溶液在冷冻时失去活性。人血清白蛋白在较低浓度（0.05%-0.1%）下能有效阻止蛋白质表面的吸附，对冻干过程中对数蛋白质有保护作用。但由于血清白蛋白潜在的血源性病原体污染限制了其在蛋白质产品中的应用。重组人白蛋白已被推荐作为血清白蛋白的替代品。

6.其他

一些表面活性剂（Tween 80、Bridger、Pluronic、十二烷磺酸钠）可以在冷冻机干燥过程中对蛋白质起到一定的保护作用。在一些冻干产品中，添加盐和胺可以获得特定的蛋白质稳定效果。不同类型的保护剂组合可以得到稳定性更好的冻干产品。

如何获得稳定的冻干蛋白产品，选择合适的保护剂非常重要。那么如何选择合适的防护剂呢？首先我们要对所要保护的蛋白药物的理化性质有充分的了解，然后通过实验找出导致蛋白药物在冻干过程和储存过程中不稳定的因素，然后针对这些不稳定因素选择具体的防护剂。一般来说，糖和多羟基化合物是常用的冻干保护剂。其中，蔗糖、海藻糖等二糖对某些蛋白质能表现出良好的保护作用。

优秀的冻干保护剂应具有多种保护性能，如高玻璃化转变温度、低吸湿性、低结晶率、不含还原基团等。但任何单一的保护剂不可能具备所有的保护特性，因此有时必须考虑2种或多种保护剂来稳定蛋白质药物。

结论

随着生物技术的快速发展，越来越多的蛋白质药物被开发出来。迄今为止，除了采用冷冻干燥技术外，还没有更有效的制备方法来制备更稳定的蛋白质产品。即使采用冻干技术制备某些蛋白质产品，仍然需要一些有效的辅助方法，例如添加冻干保护剂以增加蛋白质稳定性。近年来，冻干保护剂及其保护机制的研究更加深入。尤其是蛋白质分析方法的改进，为蛋白质保护剂的研究提供了便利。

计算机技术在冻干过程中的应用，使得能够建立相应的数学模型来模拟和分析物料在冻干过程中的真实状态，这也使得冻干技术得以改进和提高。但蛋白质稳定机制相当复杂，蛋白质冻干产品的研究有待进一步深化。开发更好的冻干保护剂和提高蛋白药物冻干产品的质量仍然是当前生物技术药物研究的重点和方向。