什么是染料聚集Farbstoff-Aggregation？
通过吸收光，染料分子进入电子激发态。吸收的能量仅存储很短的时间，并在激发态寿命结束后再次发射，例如作为荧光。
在染料溶液中，被激发的染料分子（被视为点偶极子或振荡器）如果它们之间的距离足够大，则不会相互影响。因此，整体中存在的发色团的吸收和荧光不会改变。
发色团之间的平均距离约为 5 – 10 nm，影响仅通过振荡器的“辐射场”发生，即没有直接接触。例如，通过福斯特共振能量转移（FRET）模型描述了两种染料分子之间的这种类型的相互作用。
如果发色团之间的距离变得更小，例如在非常浓缩的溶液中，则由于各个振荡器的静电力，可能会产生强烈的相互影响。由于单个染料分子的分子间相互作用，这种染料溶液的吸收和荧光行为都会发生显着变化。
罗丹明 6G 水溶液
在罗丹明6G浓水溶液的紫外/可见光谱中，在主吸收带的短波边缘可以观察到肩峰的出现。如果通过稀释溶液来改变浓度（c），并以同样的方式增加比色皿的层厚度（d），那么根据朗伯-比尔定律，人们总是可以预期相同的消光，则以下过程是观察到：等吸光点的出现。
– 所有相关物质的浓度变化是线性的，dE/dc = 0 – 表明两种（或更多）物质以一种确定的方式相互转化或彼此处于平衡状态。所以这是一个动态平衡。
解离或二聚常数可以通过实验确定：在稀释系列中，溶液的稀释始终通过层厚度的变化进行补偿，可以计算“有效消光系数”。初始浓度由未发生二聚化的高度稀释溶液的紫外光谱确定。由于各个吸收在朗伯-比尔定律中表现相加，因此可以使用反应方程或质量作用定律来制定有效消光或有效消光系数。
疏水相互作用
有机染料的聚集尤其发生在水或具有高离子强度的溶剂中。主要原因是分子间范德华力：通过所谓的“疏水相互作用”，亲脂性分子试图“避开”亲水性水分子，即为水化壳提供尽可能小的表面积。这种现象还导致玻璃表面上的染料吸附或与基质分子的非特异性结合。
形成二聚体或更高聚集体的倾向取决于
由于这是动态平衡（如上所述），因此可以通过稀释溶液将二聚体转化回单体。当测量的吸收光谱不再随着进一步稀释和层厚度的相应增加而变化时，达到“单体光谱”。对于大多数疏水性ATTO染料，这种情况发生在消光度约为 0.04 时（层厚 1 cm；c = 10 -7 – 10 -6 mol/l）。
蛋白质缀合物中的分子内相互作用/DOL 测定
当染料-NHS 酯与蛋白质的氨基反应时，可以形成染料缀合物，其中共价结合的染料分子非常接近并且可以彼此相互作用。这以同样的方式通过吸收光谱的强烈变化来表达，正如在 ATTO 565-steptavidin 缀合物的示例中可以清楚地看到的：在缀合物光谱中观察到额外的短波吸收带，
类似于浓度足够高的染料水溶液的“二聚体带”。由于在这种情况下共价结合的染料分子之间存在分子内相互作用，因此当缀合物溶液稀释时吸收光谱不会改变！
对于这种情况，染料-蛋白质比率（标记度，DOL）的确定在我们的“蛋白质标记“工作说明中进行了描述。
两种形式的聚集体之间存在基本区别：
H-聚集体（H = 低色），短波长。
当两个或多个染料分子以一种其跃迁偶极矩（通常在 S 0 – S 1过渡中彼此平行（沿着发色团系统的纵轴运行）。观察到向低色位移的吸收带 – 与单体吸收相反。
由于空间接近，电子结构相互影响，可以说，两个分子必须一起观察。能级被分裂，并且量子力学现在允许的吸收跃迁能量更高，因此波长更短。从这种较高的激发态，发生快速内部转换（IC），从而使荧光猝灭。
J-聚集体（根据 EE Jelley 的说法），长波
这种类型的聚集会导致吸收带的长波偏移，这与能带半宽度的显着减小有关。
J-聚集体通常存在于聚次甲基染料中，例如花青、部花青或类似的发色团。Jelley 和 Scheibe 使用假异花青染料独立观察到了这一现象。对于由单个染料组装形成的“超分子聚合物”的模型描述，已经提出了各种类型。对分子关系简单的描述是这样的想法：各个分子一个接一个地排列，使得跃迁偶极矩也位于一条线上。分子的共同考虑导致能级的分裂：量子力学允许的跃迁现在能量较低，
溶剂成分、盐或其他物质的添加以及浓度会极大地影响聚集。在理想条件下，可以在紫外/可见光谱中找到所描述的极窄吸收带。此外，与 H 聚集体相比，这里当然可以观察到荧光，特别是在较低温度下：发射带的最大值也很窄，仅比吸收最大值长几纳米。
根据实验条件，文献还描述了吸收带的“加宽”，这可以通过包含 J 聚集体的禁电子跃迁来解释。
ATTO 488 标记的磷脂
溶液纯氯仿中的ATTO 488标记磷脂最初因其意想不到的颜色而令人惊讶：暗淡的溶液呈现粉红色至洋红色，而不是带有亮绿色荧光的浅黄色。长波位移吸收可以通过 J 聚集体的存在来解释。当所讨论的溶液用甲醇稀释时，颜色变为通常的黄色，并且可以看到强烈的荧光。通过改变溶剂成分，聚集体被推回。
下图显示了ATTO 488标记的1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 (DPPE) 在纯氯仿和氯仿/甲醇（8:2，v/v）溶剂混合物中的溶液：
