Screen Quest 免洗Fluo-8钙检测试剂盒是美国AAT Bioquest研发的用于检测钙离子的试剂盒，Screen Quest Fluo-8 NW钙测定试剂盒提供均匀的荧光测定，用于检测细胞内钙动员。表达通过钙发出信号的感兴趣的GPCR的细胞预加载有可以穿过细胞膜的Fluo-8 NW。一旦进入细胞内，Fluo-8 NW的亲脂性阻断基团被酯酶裂解，导致带电荷的荧光染料留在细胞内。与钙结合后，其荧光大大增强。当用激动剂刺激细胞时，该受体发出细胞内钙的释放信号，这显着增加了Fluo-8 NW的荧光。 Fluo-8 NW具有长波长，高灵敏度和> 100倍荧光增强的特性，是测量细胞钙的理想指标。 Screen Quest Fluo-8 NW钙测定试剂盒为监测G蛋白偶联受体和钙通道提供了一种优化的检测方法。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且易于适应自动化。金畔生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供优质的钙检测试剂盒。

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样品分析方案

概述

用含有0.5-1％FBS的Fluo-8 NW染料加载溶液

在生长培养基中制备细胞（100μL/孔/ 96孔板或25μL/孔/ 384孔板）

在室温下孵育1小时

监测Ex / Em = 490 / 525nm处的荧光强度

操作步骤

1.准备细胞：
1.1对于贴壁细胞：在生长培养基中将细胞过夜，对于96孔板，具有0.5-1％FBS，40,000至80,000个细胞/孔/100μL，或者对于384孔板，为10,000至20,000个细胞/孔/25μL。

1.2对于非贴壁细胞：从培养基中离心细胞，然后将细胞沉淀悬浮于等量的HHBS和Fluo-8 NW染料加载溶液中（参见下面的步骤2.4），125,000至250,000细胞/孔/100μL 用于96孔poly-D赖氨酸平板或30,000至60,000细胞/孔/25μL用于384孔聚-D赖氨酸平板。 在实验之前，在制动器关闭的情况下以800rpm离心板2分钟。
注意：应根据个体评估每个细胞系，以确定细胞内钙动员的细胞密度。

2.准备Fluo-8 NW染料加载溶液：
2.1在使用前，在室温下1小瓶Fluo-8 NW（组分A），1瓶10XPluronic®F127Plus（组分B）和HHBS（组分C）。

2.2Make Fluo-8 NW储备溶液::加入20μL（Cat＃36314）或200μL（Cat＃36315和＃36316）DMSO到Fluo-8 NW（A组分）小瓶中，混匀。
注意：20μLFluo-8 NW原液足以用于一个平板。如果管子密封，未使用的Fluo-8 NW储备溶液可以等分并在<-20摄氏度下储存超过一个月。避光，避免反复冻融循环。

2.3制备1X测定缓冲液：
A）。对于Cat＃36314（1个试剂盒）和＃36315（10个试剂盒试剂盒），通过将9mL HHBS（组分C）加入10X Pluronic F127 Plus（1mL，组分B）中制备1X测定缓冲液，并充分混合。

B）。对于Cat＃36316（100个试剂盒试剂盒），将整瓶10XPluronic®F127Plus（10 mL，组分B）加入90 mL HHBS缓冲液（不包括在试剂盒中）中，制成1X试剂缓冲液，并充分混合。
注意：对于一个平板，10 mL的1X测定缓冲液就足够了。在<-20℃下等分并储存未使用的1X测定缓冲液。避光，避免反复冻融循环。

2.4为一个细胞板制备Fluo-8 NW染料加载溶液：将20μLFluo-8 NW储备溶液（来自步骤2.2）加入10 mL 1X分析缓冲液（来自步骤2.3），并充分混合。该工作溶液在室温下稳定至少2小时。

3.运行钙测定：
3.1将100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的Fluo-8 NW染料加载溶液（来自步骤2.4）加入到细胞板中。
注意：或者，在含有5-10％FBS的生长培养基中培养细胞以细胞生长。在这种情况下，重要的是用HHBS缓冲液替换生长培养基以小化背景荧光和化合物干扰血清。 [我们为那些喜欢保持培养基去除步骤的人提供2个独立的中等去除钙测定试剂盒（Cat＃36308和36309）]。

3.2将染料加载板在细胞培养箱中孵育30分钟，然后将板在室温下再孵育30分钟。
注1：如果测定需要37℃，立即进行实验，无需进一步室温孵育。
注2：如果细胞在室温下运行时间较长，可在室温下孵育细胞板1-2小时（建议孵育时间不超过2小时。）

3.3用HHBS或所需的缓冲液制备复合板。

3.4通过监测Ex / Em = 490 / 525nm处的荧光强度来运行钙通量测定。
注意：在实验前进行信号测试非常重要。不同的仪器有自己的强度范围。将信号测试强度调整到大仪器强度计数的10％至15％的水平。例如，FLIPR-384的大荧光强度计数为65,000，因此应调整仪器设置以使信号测试强度在7,000到10,000左右。

参考文献

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