膜电位荧光探针DiSBAC2(5)是美国AAT Bioquest生产的用于膜电位检测的荧光探针，DiSBAC2（5）是一种灵敏的慢响应膜电位探针，广泛用于测量许多生物系统的膜电位。通常，慢反应探针显示其跨膜分布的潜在依赖性变化，伴随荧光变化。它们的光学响应的​​幅度远大于快速响应探针的幅度（通常每mV的荧光变化为1％）。包括阳离子羰花青，罗丹明和阴离子氧杂菁的慢反应探针适用于检测由呼吸活动，离子通道渗透性，药物结合和其他因素引起的非激发细胞的平均膜电位的变化。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的膜电位荧光探针DiSBAC2(5)。 

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操作步骤

1.准备细胞：

1.1对于贴壁细胞：在生长培养基中将细胞以40,000至80,000个细胞/孔/100μL在96孔板中培养过夜，或对于384孔板以10,000至20,000个细胞/孔/25μL。

1.2对于非粘附细胞：从培养基中离心细胞，然后将细胞沉淀悬浮于等量的HHBS和MP染料加载溶液（参见下面的步骤2.2），125,000至250,000细胞/孔/100μL，96-以及聚赖氨酸d板或30,000至60,000个细胞/孔/25μL的用于384孔聚赖氨酸d板。在实验之前，在制动器关闭的情况下以800rpm 离心板2分钟。

注意：每个细胞系应在个人基础上进行评估，以确定佳的细胞密度为细胞内钙动员。

2.准备DiSBAC2（3）染料加载溶液（1板）：

2.1在高质量无水DMSO中制备10至30 mM的DiSBAC2（3）原液。应及时使用原液; 任何剩余的溶液需要被等分并冷冻在< -20 ^ö C.

注意：避免反复冻融循环，避免光照。

2.2制备2X DiSBAC2（3）染料加载 溶液： 在实验当天，将DiSBAC2（3） 固体溶解在DMSO中或将等分试样的DiSBAC2（3）储备溶液解冻至室温。用0.04％的制备的在Hanks（HHBS）20至40μM和20mM Hepes缓冲液或者缓冲您的选择，pH为7的2X工作溶液到0.08％的Pluronic ® F-127（目录＃20053）和2mM 锥虫红Plus（Cat＃2456）。通过votexing很好地混合它们。该工作溶液在室温下稳定至少2小时。

3.运行膜电位测定：

3.1将100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）DiSBAC2（3）染料加载溶液（来自步骤2.2）加入细胞板中。

注1：如果您的筛选化合物干扰g rowth培养基和血清因子，在添加DiSBAC2（3）染料加载 溶液之前，用等体积的HHBS缓冲液替换生长培养基。或者，细胞可以在无血清条件下生长。

注2：染料加载后不要洗涤细胞。

3.2将染料加载板在细胞培养箱中孵育30至60分钟。

注意：在病例中，在室温下孵育30至60分钟可能会更好。

3.3使用HHBS或所需的缓冲液制备复合板。 

3.4通过监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度（Cat＃21414）进行膜电位测定。

注意：在实验之前运行信号测试很重要。不同的仪器有自己的强度范围。将信号测试强度调整到大仪器强度计数的10％至15％的水平。例如，FLIPR-384的大荧光强度计数为65,000，因此应调整仪器设置以使其信号测试强度在7,000到10,000左右。 

参考文献

Suppression of K V 7/KCNQ potassium channel enhances neuronal differentiation of PC12 cells
Authors: Najing Zhou, Sha Huang, Li Li, Dongyang Huang, Yunli Yan, Xiaona Du, Hailin Zhang
Journal: Neuroscience (2016): 356–367