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产品参数

产品概述

我们的Cell Meter 活细胞半胱天冬酶活性检测试剂盒基于半胱天冬酶的荧光抑制剂。这些抑制剂具有细胞渗透性和非细胞毒性。一旦进入细胞，半胱天冬酶与活性半胱天冬酶共价结合。 Caspase-1主要参与促炎细胞因子的激活和细胞凋亡过程。已经证明胱天蛋白酶1对肽序列Tyr-Val-Ala-Asp（YVAD）具有底物选择性。该试剂盒使用FAM-YVAD-FMK作为半胱天冬酶1活性的荧光指示剂。 FAM-YVAD-FMK在凋亡细胞中不可逆地结合活化的半胱天冬酶1。一旦与半胱天冬酶1结合，荧光试剂保留在细胞内。结合抑制胱天蛋白酶1但不会阻止细胞凋亡的进行。

有多种参数可用于监测细胞凋亡。这种Cell Meter 活细胞半胱天冬酶1活性检测试剂盒旨在通过测量活细胞中的caspase 1活化来检测细胞凋亡。它用于定量凋亡细胞中活化的半胱天冬酶1活性，或用于筛选半胱天冬酶1抑制剂。绿色标记试剂FAM-YVAD-FMK允许通过荧光显微镜，流式细胞仪或荧光酶标仪直接检测凋亡细胞中活化的半胱天冬酶1。该试剂盒为所有必需组分提供优化的分析方案。

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实验方案

分离细胞的检测方案

概述

用密度为5×105到2×106个细胞/ mL的测试化合物制备细胞

将FAM-YVAD-FMK以1：150的比例加入到细胞溶液中

在室温下孵育1小时

将细胞沉淀，用缓冲液或生长培养基洗涤并重悬细胞

在Ex / Em = 490 / 525nm处分析细胞

注：使用前将所有部件在室温下解冻。

 

操作方法

1.根据您的特异性诱导方案，将细胞培养至适于细胞凋亡诱导的密度，但不超过2 x 106个细胞/ mL。同时，对于每种标记条件，以与诱导群体相同的密度培养非诱导的阴性对照细胞群。以下是一些诱导悬浮培养细胞凋亡的例子：

1）用2μg/ ml喜树碱处理Jurkat细胞3小时。

2）用1μM星形孢菌素处理Jurkat细胞3小时。

3）用4μg/ ml喜树碱处理HL-60细胞4小时。

4）用1μM星形孢菌素处理HL-60细胞4小时。

注意：应对每个细胞系进行单独评估，以确定诱导细胞凋亡的细胞密度。

2.通过向FAM-YVAD-FMK（组分A）的小瓶中加入50μLDMSO制备150X FAM-YVAD-FMK DMSO储备溶液。

3.将150×FAM-YVAD-FMK DMSO储备溶液（来自步骤1）以1：150的比例添加到细胞溶液中，并将细胞在37℃，5％CO 2培养箱中孵育1小时。

注1：对于FAM-YVAD-FMK标记，细胞可以浓缩至~5×10 6个细胞/ mL。 未使用的150X FAM-YVAD-FMK DMSO储备溶液应分为单次使用的等分试样并储存在-20°C。

注2：对于粘附细胞，用0.5mM EDTA轻轻提起细胞以保持细胞完整，并在用FAM-YVAD-FMK孵育之前用含血清的培养基洗涤细胞一次。

注3：适当的孵育时间取决于所用的细胞类型和细胞浓度。 优化每个实验的孵育时间。

4.将细胞以约200g旋转5分钟，并用1mL洗涤缓冲液（组分B）洗涤细胞两次。 将细胞重悬于所需量的洗涤缓冲液中。

注1：FAM-YVAD-FMK是荧光的，因此清除任何未结合的试剂以消除背景非常重要。

注2：对于分离的细胞，应将细胞浓度调节至每个微量滴定板孔中2-5×10 5个细胞/100μL等分试样，用于步骤6。

5.如果需要，用DNA染色标记细胞（如用于死细胞的碘化丙锭，或用于细胞核染色的整个群体的Hoechst）。

6.通过荧光显微镜，流式细胞仪或荧光酶标仪在Ex / Em = 490 / 525nm处检测荧光强度（对于碘化丙锭，Ex / Em = 535/635 nm;对于Hoechst染料，Ex / Em = 350 / 461纳米）。

6.1对于流式细胞仪，使用FL1通道监测荧光强度（FL2通道用于碘化丙锭染色）。

6.2用于荧光显微镜和荧光酶标仪。将100μL细胞悬浮液置于96孔黑壁/微量滴定板透明底部的每个孔中。

注意：如果需要平衡细胞浓度，调整诱导细胞的悬浮体积以接近非诱导细胞群的细胞密度。如果您的细胞治疗不会导致受刺激细胞群数量的显着损失，则此调整步骤是可选的。

6.3使用FITC通道在荧光显微镜下观察细胞（用于碘化丙啶染色的TRITC通道，用于Hoechst染色的DAPI通道）。

6.4使用荧光酶标仪，使用Ex / Em = 490 / 525nm（在515nm处截止）底部读取模式监测荧光强度。

 

参考文献

Helicobacter pylori Secreted Protein HP1286 Triggers Apoptosis in Macrophages via TNF-Independent and ERK MAPK-Dependent Pathways
Authors: Raquel Tavares, Sushil Kumar Pathak
Journal: Frontiers in Cellular and Infection Microbiology (2017): 58

Death receptor 3 mediates necroptotic cell death
Authors: Sebastian Bittner, Gertrud Knoll, Martin Ehrenschwender
Journal: Cellular and Molecular Life Sciences (2016): 1–12

Helicobacter pylori protein JHP0290 exhibits proliferative and anti-apoptotic effects in gastric epithelial cells
Authors: Raquel Tavares, Sushil Kumar Pathak
Journal: PloS one (2015): e0124407

 

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