Annexin V-Cy5.5标记是美国AAT Bioquest研发的用于检测细胞功能的探针，膜联蛋白是钙依赖性磷脂结合蛋白家族。 它们富含真核生物，属于参与信号转导的普遍存在的细胞质蛋白家族。 膜联蛋白V的优先结合配偶体是磷脂酰丝氨酸（PS），其通常保持在细胞膜的内叶（细胞质侧）。 在细胞凋亡中，PS被转移到质膜的外部小叶。 磷脂酰丝氨酸在细胞表面上的出现是细胞凋亡的初始/中间阶段的通用指示，并且可以在观察到形态变化之前检测到。 我们的膜联蛋白V结合物是一组监测细胞功能的工具，旨在通过测量磷脂酰丝氨酸的易位来监测细胞凋亡。

膜联蛋白V结合物在Ca²⁺存在下与凋亡细胞表面上的PS结合，它也可以通过坏死细胞膜或死细胞并与细胞内部的PS结合。 因此，我们建议将细胞不可渗透的核染色与膜联蛋白V结合物结合使用，以区分死细胞和凋亡细胞。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Annexin V-Cy5.5检测试剂。 

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分析方案

概述

用测试化合物（200μL/样品）制备细胞

添加Annexin V结合物测定溶液

室温孵育30-60分钟

用流式细胞仪或荧光显微镜分析

1.用膜联蛋白V缀合物制备和孵育细胞：

1.1制备膜联蛋白V结合测定缓冲液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl₂，pH 7.4。

1.2用测试化合物处理细胞一段所需的时间（用星形孢菌素处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。

1.3离心细胞，得到1-5×10⁵个细胞/管。

1.4将细胞重悬于200μL膜联蛋白V结合测定缓冲液中（来自步骤1.1）。

1.5在细胞中加入2μL膜联蛋白V结合物。

可选：在细胞内加入死细胞染色剂如碘化丙锭，用于坏死细胞。

1.6在室温下孵育30至60分钟，避光。

1.7在用流式细胞仪或荧光显微镜分析细胞之前，加入300μL膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）以增加体积（参见下面的步骤1.8）。

1.8使用流式细胞仪或荧光显微镜监测荧光强度（参见下面的步骤2或3）。

2.使用流式细胞仪分析：

通过使用具有适当过滤器的流式细胞仪来量化膜联蛋白V缀合物。

注意：粘附细胞上的膜联蛋白V结合流式细胞术分析未经常检测，因为在细胞分离或收获期间可能发生特定的膜损伤。 然而，Casiola-Rosen等人先前报道了利用膜联蛋白V对贴壁细胞类型进行流式细胞术的方法。 和van Engelend等人（见参考文献1和2）。

3.使用荧光显微镜分析：

3.1移取步骤1.6的细胞悬液，用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）冲洗1-2次，然后用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）重悬细胞。 将细胞添加到盖有玻璃盖玻片的载玻片上。

注意：对于粘附细胞，建议直接在盖玻片上生长细胞。 与膜联蛋白V缀合物孵育（步骤1.6）后，用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）冲洗1-2次，并将膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）加回到盖玻片中。 在玻璃载玻片上翻转盖玻片并观察细胞。 在与膜联蛋白V缀合物孵育后，细胞也可以在2％甲醛中固定，并在显微镜下观察。

3.2在荧光显微镜下用适当的滤光片分析膜联蛋白V缀合物的凋亡细胞

数据分析

        下图是使用流式细胞仪检测膜联蛋白V-mFluor Violet 450与磷脂酰丝氨酸在Jurkat细胞凋亡中的结合活性的实例。 在活的非凋亡细胞中，膜联蛋白V-mFluor Violet 450检测非诱导细胞中的先天性细胞凋亡，其通常为所有细胞的2-6％。 在凋亡细胞中，膜联蛋白V-mFluor Violet 450与磷脂酰丝氨酸结合，磷脂酰丝氨酸位于细胞膜的外部小叶上，导致染色强度增加。

图1.在Jurkat细胞中检测膜联蛋白VmFluor Violet 450和磷脂酰丝氨酸的结合活性。 将Jurkat细胞在37℃，5％CO₂培养箱中不用（蓝色）或用1μM星形孢菌素（红色）处理5小时，然后用Annexin V-mFluor Violet 450染色30分钟。 使用FACSCalibur（Becton Dickinson，San Jose，CA）流式细胞仪，使用紫外激光在Ex / Em = 405 / 450nm下测量膜联蛋白V-mFluor Violet 450的荧光强度。

参考文献

Resources-Application Notes Phenotypic and Epigenetic Mechanism of Action Determinations of Histone Methylase and Demethylase Inhibitors using Digital Widefield Microscopy
Authors: Brad Larson, Peter Banks
Journal: Experimental Biology (2017)

Targeted Magnetic Intra-Lysosomal Hyperthermia produces lysosomal reactive oxygen species and causes Caspase-1 dependent cell death
Authors: Pascal Clerc, Pauline Jeanjean, Nicolas Halalli, Michel Gougeon, Bernard Pipy, Julian Carrey, Daniel Fourmy, Véronique Gigoux
Journal: Journal of Controlled Release (2017)