胱天蛋白酶Caspase抑制剂mFluor 510-VAD-FMK是美国AAT Bioquest生产的用于Caspase的试剂，FAM- VAD具有绿色荧光细胞渗透性抑制靶向胱天蛋白酶1 ，2，3 ，6，8 ，9或10 。一旦进入细胞，所述抑制剂共价结合胱天蛋白酶，产生绿色荧光。当加入到细胞群体中， FAM- VAD -FMK探针进入每个细胞与共价结合到驻留在胱天蛋白酶活性的异二聚体的VAD-FMK，从而抑制酶活性的反应性半胱氨酸残基。结合的标记试剂被保留在细胞内，而任何未结合的试剂将扩散出细胞，并冲走。绿色荧光信号的直接测量活性胱天蛋白酶的存在于细胞中的试剂加入的时间量。含有结合的标记试剂细胞可以通过96 – 孔板的基于荧光，荧光显微镜或流式细胞仪进行分析。该探头具有光谱性质类似于Pacific Blue®和BD Horizon V450 ，Pacific Blue这样的过滤器®和BD Horizon V450可以方便的用流式细胞仪或显微镜使用。该探头是特别设计用于多色检测半胱氨酸蛋白酶与紫激光装备 。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的胱天蛋白酶Caspase抑制剂mFluor 510-VAD-FMK。 

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样品操作及分析

以下协议仅提供指导，应根据您的特定需求进行修改。

使用AMC，AFC，pNA，R110和ProRed底物的常规解决方案胱天蛋白酶测定

1.在DMSO中准备10 mM的储备溶液。

2.如下准备2X半胱天冬酶底物（50 µM）分析溶液：50 µL底物原液，100 µL DTT（1M），400 µL EDTA（100 mM），10 mL Tris Buffer（20 mM），pH = 7.4。

3.将等体积的半胱天冬酶标准品或样品与2X半胱天冬酶底物测定溶液混合，并在室温下孵育至少1小时。

4.使用荧光酶标仪监测荧光，或使用酶标仪监测吸光度。

使用细胞渗透性FMK Caspase探针的细胞Caspase测定

1.在DMSO中准备2-5 mM的储备溶液。

2.根据需要处理细胞。

3.通过用20 mM Hepes缓冲液（HHBS）在Hanks中稀释DMSO储备溶液（来自步骤2.1），制备2X渗透性半胱天冬酶底物（20 µM）分析溶液。

4.将等体积的处理过的细胞与2X半胱天冬酶底物测定溶液混合（来自步骤2.3），并在37°C，5％CO2的培养箱中孵育细胞至少1小时。

5.用HHBS清洗细胞至少一次。

6.通过流式细胞仪，荧光显微镜或荧光酶标仪监测荧光强度。

使用细胞渗透性FMK Caspase探针进行细胞半胱天冬酶测定（仅适用于＃13470-13476）

1.通过向小瓶中加入50 µL DMSO制备250X储备液。

2.根据需要处理细胞。

3.以1：250的比例将250 X DMSO储备溶液添加到细胞溶液中（例如2 µL至500 µL细胞），并将细胞在37°C，5％CO2的培养箱中孵育1小时。

4.用HHBS清洗细胞至少一次。

5.通过流式细胞仪，荧光显微镜或荧光酶标仪监测荧光强度。

参考文献

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