ReadiLink Rapid mFluor 420 蛋白标记试剂盒提供了一种以微观方式标记抗体的最便捷方法。该试剂盒仅需要两个简单的混合步骤而无需纯化步骤。 试剂盒中使用的iFluor 和mFluor 染料的琥珀酰亚胺酯（SE）显示出与蛋白质的脂族胺的良好反应性和选择性，并形成羧酰胺键，其与天然肽键相同且稳定。 iFluor 和mFluor-抗体缀合物可用于免疫荧光染色，荧光原位杂交，流式细胞术和其他生物学应用。 每个ReadiLink 抗体标记试剂盒都提供了进行两次偶联反应（2×50μg蛋白质）的所有必需成分。 每个试剂盒可用于标记50-100μg单克隆，多克隆抗体或其他蛋白质（> 10 kDa），只需两个简单的混合步骤。抗体标记试剂盒ReadiLink Rapid mFluor 420是美国AAT Bioquest研发的产品。

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标准操作规程（标记50μg蛋白质）

      将所有组分加热并在打开前将样品瓶短暂离心，并在开始结合前立即准备所需的溶液。 以下SOP是标记抗HDAC IgG抗体的实例。

1.准备蛋白质溶液（溶液A）：

为了标记50g蛋白质（假设目标蛋白质浓度为1mg / mL），将5L（总反应体积的10％）的反应缓冲液（组分B）与50L目标蛋白质溶液混合。

注1.如果您的蛋白质浓度不同，请相应调整蛋白质体积，使~50μg蛋白质可用于标记反应。

注2：为了标记100g蛋白质（假设目标蛋白质浓度为1mg / mL），将10μL（总反应体积的10％）反应缓冲液（组分B）与100μL目标蛋白质溶液混合。

注3：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中;如果蛋白质溶解在甘氨酸缓冲液中，必须用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析，或使用Amicon Ultra-0.5超滤瓶，Ultracel-10超滤膜膜，10 kDa（来自Millipore的cat＃UFC501008）去除用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和乙酸铵）。

注4：不纯的抗体、稳定的牛血清蛋白（BSA）抗体或明胶不会被很好的标记。

注5：如果蛋白质浓度小于1 mg / mL，则结合效率明显降低。为获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为1-2 mg / mL。

2.运行结合反应：

2.1将蛋白质溶液（溶液A）加入一瓶标记染料（组分A）中，通过反复移液几次将其混合均匀，或将小瓶涡旋几秒钟。

注意：如果要标记100 µg蛋白质，请使用两个小瓶（组分A），将100 µg蛋白质分成2 x 50 µg蛋白质，并使每个50 µg蛋白质与一小瓶标记染料反应，然后合并两个小瓶，用于下一步。

2.2将缀合反应混合物在室温下保持30-60分钟。

注意：如果需要，可以旋转或摇动缀合反应混合物更长的时间。

3.停止共轭反应：

3.1加入5 µL TQ染色淬灭缓冲液（组分C）（对于50 µg蛋白质）或加入10 µL TQ染色淬灭缓冲液（组分C）（对于100 µg蛋白质）。加入的缓冲液是总反应体积的10％。

3.2在室温下孵育10分钟。

3.3标记的蛋白质（抗体）现在可以使用了。

参考文献

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