上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品，欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。
Amplite 荧光法β-半乳糖苷酶检测试剂盒 绿色荧光 价格 4245
产品规格
产品货号
| Ex (nm) | 498 | Em (nm) | 517 |
| 分子量 | – | 溶剂 | – |
| 存储条件 | – |
E.coliβ-半乳糖苷酶是一种464kD的四聚体。β-半乳糖苷酶的每个单元由五个结构域组成，其中第三个是活性位点。它是细胞中的一种必需酶。这种酶的缺乏会导致半乳糖苷中毒或莫奎奥B综合征。在大肠杆菌中，β-半乳糖苷酶是通过激活LacZ操纵子而产生的。LacZ表达的检测已成为常规，检测到的-每细胞半乳糖苷酶。该试剂盒使用荧光半乳糖苷酶底物，可以敏感地区分LacZ+和LacZ细胞。它可以用于检测ELISA型检测系统中的半乳糖苷酶缀合物或用于监测细胞中LacZ基因的表达。半乳糖苷酶裂解产物的发射光谱可以用大多数配备FITC滤波片的荧光仪器检测。
点击查看光谱
样品实验方案
简要概述
1.用LacZ基因制备稳定或瞬时转染的细胞
2.用测试化合物孵育细胞（样品）
3.裂解细胞
4.将裂解液转移至微量滴定板
5.添加FDG工作解决方案
6.根据细胞类型，在室温或37°C孵育至少5分钟
7.添加停止解决方案
8.监测Ex / Em = 490/525 nm的荧光强度
溶液制备
1.储备溶液
所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1 FDG储备溶液（1倍）：
将125 µL DMSO（组分E）加入FDG（组分A）小瓶中，制成1X FDG储备液。 注意：25 µL FDG足以装满1个板，避光。
2.标准溶液
β-半乳糖苷酶标准品
可选（如果需要标准曲线）：用0.3％β-巯基乙醇测定缓冲液制备一系列β-半乳糖苷酶（大肠杆菌）标准品的稀释液。 将标准曲线上每个点的等分试样50 µL转移至平板的对照孔中。 β-半乳糖苷酶的高推荐量为200 mU / mL（200-400 ng）。 建议对标准曲线进行2倍系列稀释，包括8个点。 注意：调整标准曲线以适合特定的实验条件，例如细胞类型，数量，转染效率和培养板的大小。 每次进行测定时，必须新鲜制备标准曲线的稀释液。
3.工作溶液
3.1 0.3％β-巯基乙醇测定缓冲液：
将30 µLβ-巯基乙醇（组分F）添加到10 mL反应缓冲液（组分B）中，并充分混合。
注意：制备酶稀释缓冲液需要额外的缓冲液，用于生成标准曲线。
3.2 FDG工作方案：
将25 µL 1X FDG储备溶液加到5 mL的0.3％β-巯基乙醇测定缓冲液中。 注意：请勿将FDG溶液在室温下长时间放置，否则会发生自发水解。
3.3 裂解缓冲液工作液：
使用前，将5 µLβ-巯基乙醇（组分F）加入5 mL裂解缓冲液（组分D）中。 注意：在裂解细胞之前，将0.1％β-巯基乙醇添加到裂解缓冲液中
样品操作及分析
表1.细胞培养板推荐的Lysis Buffer工作溶液体积
| 培养板类型 | 裂解缓冲液工作溶液（µL /孔） |
| 96孔板 | 50 |
| 24孔板 | 250 |
| 12孔板 | 500 |
| 6孔板 | 1000 |
| 60毫米板 | 2000 |
| 100毫米板 | 4000 |
1.从哺乳动物细胞制备细胞提取物
1.1用测试化合物处理含有LacZ基因的细胞所需的时间。
1.2用1X PBS洗涤细胞两次。不要移动细胞。
1.3用Lysis Buffer工作溶液相应地裂解细胞。
1.3.1对于贴壁细胞：将Lysis Buffer工作溶液添加至培养板。有关建议的数量，请参见表1。
1.3.2对于非贴壁细胞：将细胞沉淀到离心管中，并向管中加入50-2000 µL Lysis Buffer工作溶液（取决于细胞沉淀的大小）。
1.4将上一步的细胞在室温下孵育10-15分钟，然后轻轻旋转平板或试管数次以确保完全裂解。
1.5继续进行FDG测定或将样品在-80°C下冷冻直至使用。注意：通过快速的冻融循环（在-20°C到-80°C冷冻1-2小时，然后在室温解冻）也可以获得良好的裂解。或者，将细胞裂解液离心2-3分钟以沉淀不溶物，然后测定上清液。
2.运行ß-半乳糖苷酶测定
2.1如果需要，在室温下解冻裂解细胞管或板。如果细胞接种在96孔板上，则直接在96孔板上进行测定。
2.2在96孔板的每个孔中加入50 µL细胞提取物。如果需要标准曲线，请为标准曲线保存一些对照孔（50 uL /孔）。注意：如有必要，当转染效率很高时，可在裂解缓冲液工作溶液中稀释裂解液，或在转染效率低时减少裂解液的体积。如果在96孔板上进行转染，或将稳定的细胞系接种到96孔板上，请直接在板上进行测定。对于内源性β-半乳糖苷酶活性控制，请添加50 µL非转染细胞的细胞裂解液。对于空白对照，添加50 µL 1X裂解缓冲液。
2.3向每个孔中加入50 µL FDG工作溶液。根据细胞类型，将板在室温或37°C下孵育大约5分钟至4小时。
2.4向每个孔中添加50 µL终止缓冲液（组分C）。终止缓冲液除了终止反应之外，还引起产物的荧光强度增加。
2.5用荧光酶标仪在Ex / Em = 490/525 nm处测量每个孔中溶液的荧光强度。
2.6根据线性标准曲线定量ß-半乳糖苷酶表达。
参考文献
BZLF1 Attenuates Transmission of Inflammatory Paracrine Senescence in Epstein-Barr Virus-Infected Cells by Downregulating Tumor Necrosis Factor Alpha
Authors: Xubing Long, Yuqing Li, Mengtian Yang, Lu Huang, Weijie Gong, Ersheng Kuang
Journal: Journal of Virology (2016): 7880–7893
相关产品
| 产品名称 | 货号 |
| Amplite 荧光法β-半乳糖苷酶检测试剂盒 | Cat#12603 |
| Amplite 比色法β-半乳糖苷酶检测试剂盒 | Cat#12604 |