Amplite 乙醇定量试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于乙醇检测的试剂盒，在生命科学研究，临床评估以及食品和药物工业中，非常需要快速进行乙醇定量测量的能力。 该非放射性乙醇测定基于醇氧化酶对乙醇的氧化。 该试剂盒使用我们的Amplite Red，使该套件可以双模式记录，荧光测量还是比色读数。 该试剂盒为所有必需组分提供优化的分析方案。 该测定是稳定的，灵敏的，并且可以容易地适用于需要测量乙醇的各种应用中的高通量测定。 该测定可在30分钟内完成。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 乙醇定量试剂盒。 

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样品实验方案

简要概述

准备乙醇工作溶液（50μL）
添加乙醇标准品或测试样品（50μL）
在室温下孵育5-30分钟
监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度（截止= 570 nm）

溶液制备

1.储备溶液配制

        除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1. 1Amplite 乙醇试剂原液（250X）：
将40μLDMSO（组分D）加入到Amplite 乙醇试剂（组分A）的小瓶中以制备250X Amplite 乙醇试剂储备溶液。 应立即使用原液。 注意：Amplite 乙醇试剂在硫醇如二硫苏糖醇（DTT）和2-巯基乙醇存在下不稳定。 反应中DTT或2-巯基乙醇的浓度应不高于10μM。 Amplite 乙醇试剂在高pH（> 8.5）下也不稳定。 因此，反应应在pH 7-8下进行。推荐提供的测定缓冲液（pH 7.4）。

1.2乙醇酶混合物（100X）：
将100μL测定缓冲液（组分B）加入到乙醇酶混合物（组分C）的小瓶中并充分混合以制备100X乙醇酶混合物。

2.标准溶液配制

2.1乙醇标准溶液配制
通过将适量的100％乙醇标准品（组分E）稀释到H 2 O中来制备乙醇标准品，以产生0％至0.1％的乙醇浓度。 包含0％乙醇对照作为空白对照。 乙醇浓度应低两倍（即0％至0.05％）。

3.工作溶液配制

将20μL250XAmplite 乙醇试剂储备溶液和50μL100X乙醇酶混合物加入5mL分析缓冲液（组分B）中以制备乙醇工作溶液。

操作步骤

表1.实心黑色96孔微孔板中乙醇标准品和测试样品的布局。

ES =乙醇标准品（ES1-ES7,0.0001％至0.1％），BL =空白对照，TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成

1.根据表1和2中提供的布局制备乙醇标准品（ES），空白对照品（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25μL试剂代替50μL。注意：高浓度的乙醇（例如0.5％终浓度）可能会由于Amplite 乙醇试剂的过度氧化（导致非荧光产物）而导致荧光信号降低。

2.向乙醇标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50μL乙醇工作溶液，使总乙醇测定体积为100μL/孔。对于384孔板，在每个孔中加入25μL乙醇工作溶液，总体积为50μL/孔。

3.在室温下孵育反应5至30分钟，避光。

4.用荧光板读数器在激发= 530-570nm，发射= 590-600nm（Ex / Em = 540 / 590nm），截止= 570nm监测荧光强度。注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

数据分析

        从空白标准孔获得的读数（RFU）用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。 然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。 该等式可用于计算EtOH样品。 点击使用在线线性回归计算器。

图1.使用Gemini荧光酶标仪（Molecular Devices），在固体黑色96孔板上用Amplite 乙醇定量试剂盒测量乙醇剂量响应。

试剂应用文献

参考文献

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