500 Tests

产品参数

产品概述

Amplite 比色法过氧化氢检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于过氧化氢的试剂盒，过氧化氢（H₂O₂）是一种活性氧代谢副产物，可作为许多氧化应激相关状态的关键调节剂。它参与许多与哮喘，动脉粥样硬化，糖尿病性血管病变，骨质疏松症，一些神经退行性疾病和唐氏综合症相关的生物事件。也许H₂O₂生物学引人入胜的方面是近的报道，抗体有能力将分子氧转化为过氧化氢，从而有助于免疫系统的正常识别和破坏过程。测量这种反应物种将有助于确定氧化应激如何调节不同的细胞内途径。此Amplite 比色过氧化氢检测试剂盒使用我们独特的Amplite IR过氧化物酶底物来定量溶液和细胞提取液中的过氧化氢。在过氧化氢氧化时，无色的Amplite IR产生强烈的蓝色产物，其pH值与pH 4至10无关。现有比色法过氧化氢分析（来自其他供应商）通常具有严重的样品干扰，这些样品干扰是由生物样品的固有吸收。 Amplite IR产品的近红外吸收大限度地减少了测定背景，因为生物样品很少吸收超过600 nm的光。它也可以用于通过酶偶联反应检测各种氧化酶活性。该试剂盒是与HTS液体处理仪器兼容的优化“混合和读取”分析。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 比色法过氧化氢检测试剂盒。

 

适用仪器

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光吸收酶标仪
吸收:	650nm
推荐孔板:	透明底板

实验方案

样品实验方案

简要概述

1.准备H₂O₂工作溶液（50μL）
2.添加H₂O₂标准品或测试样品（50μL）
3.在室温下孵育10-60分钟
4.监测650 nm处的吸光度

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1. Amplite IR过氧化物酶底物储备液（100X）：
将250μLDMSO（组分E）加入到Amplite IR过氧化物酶底物（组分A）的小瓶中。

2.过氧化物酶原液（20 U / mL）：
将1mL测定缓冲液（组分C）加入到辣根过氧化物酶（组分D）的小瓶中。

3. H₂O₂标准溶液（20 mM）：
将22.7μL的3％H₂O₂（0.88M，组分B）加入977μL的测定缓冲液（组分C）中。 注意：稀释的H₂O₂储备溶液不稳定。 应丢弃未使用的部分。

 

2.标准溶液

H₂O₂标准
将5μL20mM H₂O₂标准溶液加入995μL测定缓冲液（组分C）中，得到100μM H₂O₂标准品（HS7）。 取200μL100μM H₂O₂标准品进行1：2连续稀释，得到 H₂O₂标准品（HS6-HS1）的连续稀释液。

 

3.工作溶液

将50μLEKYellow 储备液和50μL肠激酶底物储备液加入5 mL分析缓冲液（组分C）中; 混合均匀，制成肠激酶（EK）工作溶液（组分A + B + C）。 注意：对于一个96孔板，测定混合物就足够了。 它不稳定，立即使用。

 

样品分析

表1.白壁/透明底96孔板中H2O2标准品和测试样品的布局。 HS = H2O2标准品（HS1-HS7,1.563至100μM）; BL =空白对照; TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
HS1	HS1	…	…
HS2	HS2	…	…
HS3	HS3
HS4	HS4
HS5	HS5
HS6	HS6
HS7	HS7

表2.每个孔的试剂组成

孔	容积	试剂
HS1-HS7	50ul	连续稀释（1.563至100μM）
BL	50ul	分析缓冲液（组分B）
TS	50ul	测试样本

1.H₂O₂测定上清液反应

1.1根据表1和2中提供的布局制备H2O2标准品（HS），空白对照品（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25μL试剂代替50μL。

1.2向H₂O₂标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50μLH₂O₂工作溶液，使总H₂O₂测定体积为100μL/孔。 对于384孔板，在每个孔中加入25μLH₂O₂工作溶液，总体积为50μL/孔。

1.3在室温下孵育反应10至30分钟，避光。

1.4用吸光度读板仪在650nm处监测吸光度。

 

H₂O₂测定细胞
Amplite 比色过氧化氢检测试剂盒可用于测量细胞中H₂O₂的释放。以下是建议的说明书，可以进行修改以满足特定的研究需求。

除了应使用细胞培养系统中使用的培养基替换测定缓冲液（组分C）外，应按照给定的方式制备H₂O₂细胞工作溶液。建议的培养基包括（a）Krebs Ringers磷酸盐缓冲液（KRPB）; （b）中。汉克斯平衡盐溶液（HBSS）;或（c）无血清培养基。

在96孔板（50-100μL/孔）中制备细胞，并根据需要细胞。注意：包括阴性对照（单独的培养基和非活化细胞）用于测量背景荧光。

向细胞和H₂O₂标准品的每个孔中加入50μL H₂O₂细胞工作溶液，使总H2O2测定体积为100μL/孔。对于384孔板，在每个孔中加入25μLH₂O₂细胞工作溶液，总体积为50μL/孔。

在室温下孵育反应10至60分钟，避光。

用吸光度读板仪在650nm处监测吸光度。

 

参考文献

Plasma-activated medium selectively eliminates undifferentiated human induced pluripotent stem cells
Authors: Ryo Matsumoto, Kazunori Shimizu, Takunori Nagashima, Hiromasa Tanaka, Masaaki Mizuno, Fumitaka Kikkawa, Masaru Hori, Hiroyuki Honda
Journal: Regenerative Therapy (2016): 55–63

 

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