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免疫荧光 (IF)介绍

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免疫荧光 (IF)介绍

免疫荧光是一种免疫染色技术，可使用荧光显微镜观察样品中的抗原。使用有机溶剂和化学交联剂仔细固定样品，以保持其细胞完整性以及亚细胞结构。然后对它们进行透化以进行免疫染色，然后进行封闭以尽量减少非特异性结合。然后用抗体对样品进行免疫染色，并通过荧光反应使目标颜色可视化。

免疫荧光 (IF)介绍

材料

  • 10X PBS：要制备 1L，将 80g NaCl、2g KCl、2g KH2PO4 和 28.5g NaHPO4 添加到 1L 注射用水中。将 pH 值调整至 7.4。

  • 4% 聚甲醛：要制备 100mL，将 4g 聚甲醛添加到 100mL 1×PBS 中。将 pH 值调整至 7.4。

  • 1×PBS/0.2% Triton X-100(PBS/Triton)：要制备 500mL，将 1mL Triton X-100 添加到 500mL 1× PBS 中。

  • 1×PBS/3% BSA(PBS/BSA)：配制100mL时，将3g BSA加入到100mL 1×PBS中。

协议

    准备 固定 透化

  1. 在 PBS 中短暂冲洗细胞。

  2. 吸出PBS，用4%聚甲醛覆盖细胞至2-3mm深度约200ul。

  3. 让细胞在室温下固定 15 分钟。

  4. 吸出固定液，用 PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。

  5. 吸出PBS，用PBS/Triton在室温下将细胞覆盖至2-3mm深度约200ul 5分钟。

  6. 吸出渗透剂在 PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。

免疫染色

  1. 将 200ul 用 PBS/BSA 稀释的一抗轻轻添加到 24 孔板的每孔中。

  2. 37℃ 孵育 60 分钟或 4℃ 过夜。

  3. 吸出稀释的一抗，然后在 PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。

  4. 将用 PBS/BSA 稀释的荧光染料偶联二抗加入到 24 孔板中，每孔 100ul，室温避光孵育 30 分钟。

  5. 吸出稀释的荧光染料偶联二抗，然后在 PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。

  6. 在荧光显微镜下测试。

双染法免疫荧光组织化学染色步骤

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双染法免疫荧光组织化学染色步骤

如果同一标本中需要同时显示A、B两种抗原，则A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用TRITC标记，可采用以下染色方法用过的：

免疫荧光细胞化学双染

原代培养的大鼠端脑细胞第14天胚胎：在成骨形态蛋白的诱导下，乙酰胆碱转移酶（绿色荧光）和同源结构域蛋白Islet-1（红色荧光）共存于细胞质中（激光扫描共存）。聚焦显微镜观察）

1.一步双染法，将两种荧光标记抗体按适当比例（A+B）混合，按照直接法进行染色。

2.两步双染法，先用TRITC标记的抗体A进行免疫荧光染色，然后用FITC标记的抗体B进行免疫荧光染色。根据两种抗体的动物种类，可以采用直接法或间接法。结果是A抗原呈橙红色荧光，而B抗原呈黄绿色荧光。在应用中，常用的方法是免疫荧光组织化学中的间接法与荧光染料SABC-Cy3法的结合。例如，在实验设计中，选择小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作为两种不同的特异性一抗，匹配的二抗分别为FITC-抗小鼠IgG和生物素化抗兔。免疫球蛋白G。

进行双染时，由于两种一抗来源不同，可能会混合一抗。孵育后，清洗未结合的一抗。滴加二抗时，先加入人生物素化抗兔IgG（二抗）孵育。清洗后，滴下 SABC-Cy3 复合物。特异性荧光，然后与FITC-抗小鼠IgG（二抗）孵育，最后封片观察。结果，A抗原显示绿色荧光，B抗原显示红色荧光。

该方法中需要注意的是，两种一抗混合稀释时，抗体的终浓度应为每种抗体的工作浓度。也就是说，混合液要同时满足两种一抗的工作浓度。如果两个一抗来自同一物种，则必须进行两次双染，即A抗原先用第一个一抗和第一个荧光二抗染色，然后用第二个一抗和第一个荧光二抗洗涤荧光二抗。 B抗原染色需使用两种荧光二抗，否则会发生交叉反应，导致染色不特异。