PI单染法实验原理及步骤

PI单染的原理主要是根据细胞凋亡过程中细胞、亚细胞和分子水平发生的特征性变化。这些变化包括细胞核的变化、细胞器的变化、细胞膜成分的变化和细胞形态的变化，其中细胞核的变化很有特征。

PI简介

荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可以对DNA进行染色的核染色试剂。它常用于细胞凋亡检测。英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙锭类似物，嵌入双链 DNA 后会发出红色荧光。虽然 PI 不能穿过活细胞膜，但它可以穿过受损的细胞膜并对细胞核进行染色。 PI 通常与 Calcein-AM 或 FDA 等荧光探针一起使用，以同时对活细胞和死细胞进行染色。 PI-DNA复合物的激发波长和发射波长分别为535 nm和615 nm。

外观：红棕色粉末储存条件：-20℃

PI单染法实验原理

1、细胞核的变化：由于凋亡细胞细胞核的变化，导致各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA的染色性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对固定的凋亡细胞进行染色会降低 DNA 染色能力。许多学者将 DNA 染色性的降低视为凋亡细胞的标志之一。

2.光散射特性：凋亡细胞形态的变化影响其光散射特性。在流式细胞仪上，前向散射光与细胞的大小有关，而侧向散射光反映了细胞内光的折射，与细胞内颗粒的数量有关。细胞凋亡时，细胞收缩，体积变小，因此前向散射光减少。这一特征通常被认为是凋亡细胞的特征之一。另外，由于细胞凋亡时染色体的降解和核破裂的形成，细胞内颗粒常增多，故凋亡细胞的侧向散射光常增多。细胞坏死时，由于细胞肿胀，前向散射光增加；细胞坏死时侧向散射光也增加，因此根据前向散射光和侧向散射光可以区分凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前向散射光和侧向散射光判断凋亡细胞的可靠性，很大程度上受检测细胞形态的均匀性和核质比的影响。因此，在某些淋巴细胞凋亡中，通过光散射特性检测细胞凋亡的可靠性较好，但在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性较差。基于光散射特性检测凋亡细胞的主要优点是，光散射特性可以与细胞的表面免疫荧光分析相结合，以区分经过这些特殊处理后发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。它还可用于活细胞的分类。

PI 单染试剂和仪器

1、PBS溶液；
2、PI染色液：将PI溶解于PBS(pH7.4)中，终浓度为100ug/ml。储存在棕色瓶中，4°C 避光保存。
3,70%乙醇4,400目筛5，流式细胞仪

PI单染实验步骤

1.收集细胞，500~1000r/min离心5min，弃去培养基。
2.用3ml PBS洗涤一次。
3. 离心除去PBS，加入冰冷的70%乙醇固定，4℃固定1-2小时。
4. 离心弃固定液，重悬于 3ml PBS 中 5 分钟。
5. 过400目筛一次，500-1000 r/min离心5 min，弃PBS。
6. 用1ml PI染色液染色，4℃避光30min。
7、流式细胞仪检测：PI被氩离子激发产生荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，分析荧光直方图PI的强度，并分析前向散射光到侧向散射光的散射。图片。
8.结果判断：在前向散射光与侧向散射光的散点图或地形图上，与正常细胞相比，凋亡细胞的前向散射光较低，而侧向散射光可高可低，这与正常细胞相比，凋亡细胞的前向散射光较低，而侧向散射光可高可低。细胞类型；在分析PI荧光直方图时，首先使用门技术排除双或聚集的细胞以及发出微弱荧光的细胞碎片。在PI荧光直方图上，凋亡细胞在G1/G0期倍性峰之前出现一二二。例如，如果G1/G0期位置的荧光强度为1.0，则典型凋亡细胞样品的亚二倍体峰的荧光强度为0.45，则可以使用鸡和鲑鱼红细胞的PI荧光强度作为参考标准。 0.35 和 0.7，分别确保其间不是细胞碎片而是完整的细胞。

注：在细胞凋亡过程中，DNA 染色性的降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种 DNA 染色性的降低也可能是由于 DNA 含量的减少，或由于 DNA 结构的变化所致。这是由于其与染料结合的能力发生变化引起的。分析结果时应小心。