如何去除反应产物中的颜色？

您是否曾经有过纯化的反应产物，其应该是白色的，纯化后仍保留颜色？如果是这样，您采取了什么措施将其删除？

例如使用微波反应器合成2,4,6-三氯苯胺[1]时遇到了这种情况，图1。

图 1.苯胺与 N-氯代琥珀酰亚胺的微波反应。

反应产生铁锈色的粗混合物。 TLC表明产生了产物和一些副产物。使用庚烷和甲基叔丁基醚 (MTBE) 的正相快速色谱看起来很有前景，但由于反应在与庚烷不混溶的乙腈中进行，我需要将产物从反应溶剂中萃取出来，并重新溶解在与庚烷兼容的溶剂中例如二氯甲烷（DCM）。萃取还将去除一些极性副产物和过量的N-氯代琥珀酰亚胺。

用 DCM 萃取后，我添加二氧化硅并蒸发溶剂以形成干负载（约 300 毫克）。在提取物纯化过程中，一条非常紧密的铁锈色条带穿过硅胶柱，图 2。

图 2.反应混合物 DCM 提取物 (300 mg) 的正相快速纯化显示产物以非常紧密、高度着色的条带洗脱。

该条带生成了良好的色谱图，几乎没有分离的副产物，图 3。

图 3.使用 0-35% MTBE 的庚烷梯度对 300 mg 合成 2,4,6-三氯苯胺进行正相快速纯化。

从300mg上样量中回收183mg红色晶体，表明正相去除了大量杂质。

那么，产品是纯净的，对吗？嗯，不全是。根据戴维斯的文章，该产品应该是“柔软、无色的针状物”，而不是红色晶体。正如他的文章中所述，为了去除产品中的红色，他使用了活性炭和二氧化硅，但没有提供有关颜色去除方案的详细信息。

我本可以尝试使用二氧化硅和极性较小的溶剂（例如庚烷）和 DCM 进行再纯化，但决定使用反相闪蒸来使用更环保的解决方案。经过最少的方法开发后，我发现 60-100% 的甲醇梯度很有希望，图 4。

图 4.正相纯化产物的反相筛选运行。

我将硅胶纯化的红色产物（183 毫克）干燥到 C18 介质上，将其装入干燥上样容器中，并在 12 克 C18 柱上重新纯化。色谱图显示分离良好，产物与多种杂质分离，图 5。

图 5.正相产物馏分的反相快速纯化。

收集的级分表明颜色已从在级分 2 中洗脱的产物中去除，而有色级分稍后洗脱，从级分 4 开始，图 6。

图 6.反相纯化馏分。产物级分是澄清的并且在级分2处洗脱，而有色杂质稍后在级分4-7中洗脱。

将级分 2 中的产物蒸发，得到 58 mg 柔软、无色的针状物，图 6。

图6.2,4,6-三氯苯胺最终产品。

对于这项工作，我使用了以下设备：

• Biotage®引发剂+微波反应器

• Biotage® V-10 Touch 溶剂蒸发器

• Biotage® Selekt Single 快速色谱系统

• Biotage® Sphere HC（10 克）和 C18（12 克）快速色谱柱

• Biotage DLV（干式负载容器），配备 Biotage® KP-Sil 和 KP-C18-HS
  
  

因此，如果您的产品存在颜色污染，并且之前仅使用硅胶对其进行纯化，请考虑通过反相快速色谱进行再纯化。与其他技术相比，它简单、容易、更环保。

沉淀反应：环沉淀反应

可溶性抗原与相应的抗体混合。在电解质存在下，如果两者的比例合适，就会出现沉淀，称为沉淀。由于抗原多胶体溶液的沉淀反应。沉淀物主要由抗体蛋白组成。

为了获得合适的抗原抗体比例，保证有足够的抗体，并且抗原分子小，反应面积大，操作通常是稀释抗原而不是抗体。

沉淀反应的类型包括循环沉淀、絮状沉淀、胶囊溶胀、琼脂扩散和免疫电泳。此外，还有放射性同位素标记、酶标记等检测方法。

循环沉淀反应

当抗原与相应的抗体形成接触面时，若两者比例适当，可在接触面上形成乳白色环，为阳性沉淀反应。

1. 材料

(1)免疫血清：免疫兔抗人血清；

(2)抗原：人血清；

(3)小沉淀管、毛细移液管、橡皮头、生理盐水。

2. 方法

(1)取2个小沉淀管，用毛细管吸取约0.2ml抗人血清，加入到第一管中，注意不要有气泡；

(2)用毛细管移液器向第二管中加入0.2ml生理盐水；

(3) 用毛细管移液器稀释0.2ml血液并添加到每个管中。添加时应注意使抗原溶液从管壁缓慢流下，浮在血清表面，形成明显的界面。不要将它们混合；

(4)室温放置10-20分钟，观察液面是否有乳白色沉淀环，如有则为阳性。

我可以用什么来纯化极性反应混合物？

使用快速色谱法纯化极性反应混合物可能是一个真正的挑战。传统的正相闪蒸需要有毒的二氯甲烷 (DCM) 或氯仿与甲醇进行此类纯化，这可能会产生不可预测且通常不希望的结果。这些相同的化合物通常极性太大，无法保留在反相色谱柱上并在溶剂前沿（在单柱体积或 CV 内）洗脱。如果您遇到其中一个问题，称为 HILIC 的技术可能是解决方案。

那么，您可能会问自己什么是 HILIC？ HILIC是亲水相互作用液相色谱法。 这是一种用于分离和纯化极性化合物的技术，这些化合物在反相上不保留和/或对于正相来说极性太大。

一些化学家称这种技术为反相反相色谱，但实际上它是水性正相色谱。与正相一样，HILIC 使用极性固定相柱（硅胶、二醇、胺等）。然而，对于 HILIC，较弱的溶剂通常是乙腈，而强溶剂是水。如您所知，甲醇通常不适用于 HILIC 分离。

直到最近，我执行过的 HILIC 色谱法是在 20 世纪 80 年代我在另一家公司工作时开发的硅胶快速柱 QC 测试（尿嘧啶 + 胞嘧啶在醋酸铵水溶液中）和糖分离。

然而最近，我遇到了一种反应混合物，传统的正相或反相都无法有效纯化，所以我尝试了HILIC。令我高兴的是，这效果很好。

当我尝试纯化烟尿酸与苄胺反应的产物时，就出现了对 HILIC 的需求。虽然我能够通过反相进行一些分离，但我的产品未能很好地从一些副产物中分离出来，这使得我的目标分离具有挑战性，图 1。

图 1.反相快速色谱分离效果不太理想。

由于反应混合物仅溶于极性溶剂，正相提供的选择有限。我勉强尝试使用硅胶柱使用 DCM-MeOH (0-30%)，并实现了良好的分离，尽管放大纯化的空间很小，图 2。

图 2.正相快速色谱分离效果良好，但分辨率有限。

然后，我尝试使用硅胶柱（5 克 Biotage® Sfär HC）和 0-30% 乙腈水梯度进行 HILIC。这种方法提供了满足我需求的最佳结果，解决了我的产品与副产品的问题，图 3。

图 3. HILIC 快速色谱提供了产物和副产物之间的最佳分离效果和出色的分辨率。

HILIC 比传统正相快速色谱法具有优势。正相技术使用危险、有毒的有机溶剂和一次性塑料柱，不是一种环保技术。另一方面，HILIC 确实使用乙腈，但强溶剂是水，产生危险性较小的废物流。 HILIC 还允许硅胶柱在一定程度上重复使用（取决于粗反应混合物的纯度）。在处置之前，我已将硅胶柱重复用于 HILIC 应用 4 到 5 次。

聚乙二醇化脂质体：免疫反应

聚乙二醇化是聚乙二醇（PEG）链的共价连接，目前被认为是增加稳定性和延长脂质体体内循环时间的有效方法。 纳米载体，如脂质体和可生物降解的聚合物纳米颗粒，是靶向药物递送治疗癌症和许多其他疾病的有前途的工具，其中许多载体已获得临床批准，可用于递送多种治疗方法[1-5]。它们结合了生物相容性和相对无毒的优点，并具有保护封装的有效载荷免受酶降解或其他不利条件的固有能力[6，7]。此外，它们已被证明通过改变药物的药代动力学特征来提高包封药物的治疗指数并降低其毒性[8，9]。 总的来说，这些优势导致纳米级药物载体在许多临床环境中获得批准，涉及各种小分子疗法和最近的siRNA。然而，基于纳米载体的疗法在医学中的广泛使用偶尔受到对载体潜在毒性的担忧的限制。

据报道，在动物实验中，具有某些物理和化学特性的纳米载体可以启动宿主免疫系统，导致包封药物的严重不良反应和/或缺乏治疗效果[10-12]。例如，发达的纳米载体的表面静电荷和/或粒径是定义这种免疫反应的基础[13]。在这些实验中，纳米颗粒基本上被免疫细胞识别为外来颗粒，从而诱导多级免疫反应。此外，据报道，纳米颗粒与循环血清蛋白（例如属于原代体液免疫系统的补充蛋白）相互作用，导致它们被单核吞噬细胞系统（MPS）细胞快速全身清除[14，15]。 单核吞噬细胞系统（MPS）由树突状细胞（DC），单核细胞和巨噬细胞组成，是先天免疫系统的一部分，在免疫反应的所有阶段对病原体和异物的吞噬作用起着关键作用。综上所述，这些与免疫系统的相互作用有可能影响给药纳米载体的体内命运，并可能损害其治疗性能。

聚乙二醇化是聚乙二醇（PEG）链的共价连接，目前被认为是增加稳定性和延长脂质体体内循环时间的有效方法。据报道，聚乙二醇化会阻碍循环中蛋白调理素吸附到脂质体表面，导致肝脏和脾脏中单核吞噬细胞对脂质体的清除增加[16，17]。因此，聚乙二醇化改善了脂质体以及包封治疗剂在循环中的停留时间。在药物递送领域，聚乙二醇化和非聚乙二醇化脂质体已获得多项临床批准。   聚乙二醇化脂质体制剂最成功的例子是Doxil®（封装抗癌药物阿霉素（DXR）的聚乙二醇化脂质体）， 批准用于卡波西肉瘤、卵巢癌、乳腺癌和多发性骨髓瘤[18-20]。然而，聚乙二醇化脂质体引起了一些与脂质相关的副作用。在一些患者中，Doxil®在第一次注射时立即引起超敏反应。许多研究证实了补体活化在初次注射Doxil®治疗的患者中高达25%-45%的全身反应中的作用[12，21，22]。通过减慢Doxil®输注速率和给予患者用药前治疗，可以很好地控制这种反应[23，24]。多敏反应很少见于第二次及后续的Doxil®治疗[24]。初次注射时引起立即超敏反应。许多研究证实了补体活化在初次注射Doxil®治疗的患者中高达25%-45%的全身反应中的作用[12，21，22]。通过减慢Doxil®输注速率和给予患者用药前治疗，可以很好地控制这种反应[23，24]。多敏反应很少见于第二次及后续的Doxil®治疗[24]。初次注射时引起立即超敏反应。许多研究证实了补体活化在初次注射Doxil®治疗的患者中高达25%-45%的全身反应中的作用[12，21，22]。通过减慢Doxil®输注速率和给予患者用药前治疗，可以很好地控制这种反应[23，24]。多敏反应很少见于第二次及后续的Doxil®治疗[24]。24]多氧反应在第二次及以后的多克西尔®发作时很少见[24]。24]多氧反应在第二次及以后的多克西尔®发作时很少见[24]。

2.PEG的免疫原性
聚乙二醇（PEG）是一种生物惰性热弹性亲水聚合物，分子式为（C2nH4n+2On+1）。它是一种无毒、非离子的醚二醇，具有GRAS（通常被认为是安全的）设计，越来越多地用作食品添加剂和药物配方中的添加剂。在过去的几十年里，PEG被认为是非免疫原性的。然而，越来越多的证据表明，PEG可能比以前认识到的更具免疫原性。健康人中抗PEG抗体的日益增加支持了这一点，这些健康人越来越多地暴露于PEG添加剂[25，26]。例如，Armstrong等人[27]报告说，在健康献血者中，25%存在抗PEG抗体。后来， Yang和Lai[28]记录了在没有聚乙二醇化产品治疗史的患者中约42%的抗PEG抗体浓度更高。在未接受含PEG药物的健康个体中，预先存在的抗PEG抗体的患病率较高，这归因于频繁使用含PEG或PEG偶联的产品，这些产品是个人护理，美容和家庭清洁产品（例如肥皂，防晒霜，化妆品）以及加工食品中的常见成分。因此，Yang和Lai提出了PEG抗体形成的试探性机制，其中溃疡，擦伤和皮肤撕裂等各种调味品可能导致局部炎症反应和在PEG存在下诱导免疫反应。经常使用含有或与PEG耦合的产品，例如肥皂， 洗发水、牙膏、乳液或洗涤剂会导致PEG渗透到炎症部位，与免疫细胞接触会刺激抗PEG抗体的产生[28]。当人类受试者接受聚乙二醇化治疗时，预先存在的抗PEG抗体可能会引发对PEG的进一步免疫原性反应[25，26]。这些预先存在的和诱导的抗PEG抗体共同可能损害临床上对聚乙二醇化药物的反应[29-31]。 这些预先存在的和诱导的抗PEG抗体共同可能损害临床上对聚乙二醇化药物的反应[29-31]。 这些预先存在的和诱导的抗PEG抗体共同可能损害临床上对聚乙二醇化药物的反应[29-31]。

3.接枝PEG在纳米载体上的功能
如上所述，PEG已被用于脂质体、纳米颗粒和治疗性蛋白质等纳米载体的表面修饰，以增加其循环半衰期[32-36]。据报道，接枝在表面上的PEG增加了它们的亲水性并起到空间位阻屏障的作用，阻碍了纳米载体与参与MPS细胞识别载体的血清蛋白调理素之间的相互作用[17]。与非聚乙二醇化纳米载体相比，未被MPS细胞过早吸收的聚乙二醇化纳米载体（如聚乙二醇化脂质体、聚乙二醇胶束和聚乙二醇化蛋白）具有更大的机会达到并递送更高水平的治疗剂以靶向不缓解的器官。 这可能是由于聚乙二醇化在纳米载体表面上赋予的隐身特性，因此MPS细胞对聚乙二醇化纳米载体的摄取减少，这部分解释了为什么它们获得了许多临床批准[1，19，37，38]。

AA Blocks提供全面的构建块和专门设计产品支持您的研发：

等等。

上海金畔生物科技有限公司的目标成为中国生命科学和生物技术等领域坚强的后盾，为这些领域的发展提供服务。以“质量是企业的生命，诚信是经营的资本”为警醒 ,严把所售出商品的质量关,不做任何有损顾客利益的事情,公司代理国内外众多生命科学领域的研究试剂、仪器和实验室消耗品，公司坚持“一站式”服务模式，为客户全面解决实验、生产、开发需求。公司整合与国内资源，加强网络建设，提高公司内部运作效率，为客户提供方便、快捷的服务。