样品实验方案
简要概述
1.准备测试样品以及稀释的天冬氨酸标准品（50 µL）
2.加入等体积的工作溶液（50 µL）
3.在37°C下孵育20-30分钟
4.监测Ex / Em = 540/590 nm的荧光强度
溶液制备
1.储备溶液
所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1 天冬氨酸标准溶液（10 mM）：
将100 uL ddH2O加入天冬氨酸标准样品瓶（组分E）中，制成10 mM天冬氨酸标准溶液。
1.2 Amplite Red底物储备液（200X）：
向Amplite Red底物（组分A）中加入50 µL DMSO（组分F），制成200X Amplite Red底物原液。
2.标准溶液
天冬氨酸标准
向990 µL 1X PBS缓冲液中加入10 µL 10 mM天冬氨酸标准液，得到100 µM天冬氨酸溶液（ASP7）。然后在1X PBS缓冲液中进行1：3的系列稀释，以得到系列稀释的天冬氨酸标准品（ASP6-ASP1）。
3.工作溶液
3.1 Conversion Mix（100X）：
将50 µL ddH2O加入转化混合液（组分D）中，制成100X转化混合储备液。
3.2 Amplite Red：
将5 mL分析缓冲液（组分C）加入一瓶酶混合液1瓶（组分B1）中； 混合均匀。 将100μLddH2O加入一个酶混合物2小瓶中（组分B2）; 混合均匀。 将整个小瓶（100μL）的酶混合液2、25μL的200X Amplite Red底物储备液和50μL的100X Conversion Mix溶液转移到Enzyme Mix 1瓶中并充分混合。 注意：工作溶液不稳定，请立即使用，并避免直接暴露在光线下。
样品操作及实验分析
表1.黑色96孔微孔板中的天冬氨酸标准品和测试样品的布局。 ASP =天冬氨酸标准品（ASP1-ASP7，0.1至100 µM）； BL =空白对照； TS =测试样品。
| BL |
BL |
TS |
TS |
| ASP1 |
ASP1 |
… |
… |
| ASP2 |
ASP2 |
… |
… |
| ASP3 |
ASP3 |
|
|
| ASP4 |
ASP4 |
|
|
| ASP5 |
ASP5 |
|
|
| ASP6 |
ASP6 |
|
|
| ASP7 |
ASP7 |
|
|
表2.每个孔的试剂组成
| 孔 |
容积 |
试剂 |
| ASP1-ASP7 |
50ul |
连续稀释（0.1至100 µM） |
| BL |
50ul |
1X PBS缓冲液 |
| TS |
50ul |
测试样品 |
1.根据表1和表2提供的布局，准备天冬氨酸标准品（ASP），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25 µL试剂，而不是50 µL。
2.在天冬氨酸标准液，空白对照和测试样品的每个孔中加入50 µL Amplite Red™工作溶液，以使天冬氨酸总测定体积为100 µL /孔。 对于384孔板，请向每个孔中添加25 µL工作溶液，总体积为50 µL /孔。 注意：在pH 6.5至7.0下进行天冬氨酸测定。
3.将反应混合物在37°C孵育20-30分钟。
4.用荧光板读数器在Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）下监测荧光的增加。
参考文献
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货号 |
| Amplite 比色法L-天门冬氨酸（天冬氨酸）检测试剂盒 |
Cat#13828 |
