核酸检测常用的5种荧光染料的特点

核酸荧光染料对细胞核进行染色，定量测定细胞的荧光强度，从而可以测定细胞核中DNA和RNA的含量，分析细胞周期和细胞增殖情况。有多种荧光染料可以对细胞中的 DNA 或 RNA 进行染色。常用的DNA染料有碘化丙啶（PI）、DAPI、Hoechst 33342等，RNA染料有噻唑橙、吖啶橙等。

1.荧光染料PI（碘化丙啶）

荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可以对DNA进行染色的核染色试剂。它常用于细胞凋亡检测。英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙锭类似物，嵌入双链 DNA 后会发出红色荧光。虽然 PI 不能穿过活细胞膜，但它可以穿过受损的细胞膜并对细胞核进行染色。 PI 通常与 Calcein-AM 或 FDA 等荧光探针一起使用，以同时对活细胞和死细胞进行染色。 PI-DNA复合物的激发波长和发射波长分别为535 nm和615 nm。

2. EB（溴化乙锭）

溴化乙锭是一种高度敏感的嵌入荧光染料，是一种强致癌诱变剂，但价格便宜。它与 DNA 的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，每 2.5 个碱基插入大约 1 个溴化乙锭分子。 EB 的这一特性使其成为常用于琼脂糖凝胶电泳中核酸染色的核酸染料。溴化乙锭在紫外区的302nm和366nm处有吸收峰。在紫外光照射下，溴化乙锭可激发出橙红色荧光（590nm）。与 DNA 结合的溴化乙锭复合物发出的荧光比不结合 DNA 的染料强 20-30 倍，因此溴化乙锭可以检测小至 10 ng 的 DNA 带，并且非常灵敏。

3. 凝胶绿和凝胶红

Biotium公司研发推出的EB替代染料，具有与EB相似的染色效果，且在紫外光照射下不易淬灭，因此可用于胶水回收。但价格较贵。

GelRed和GelGreen是两种优秀的荧光核酸凝胶染色试剂，兼具高灵敏度、低毒性和超稳定性。其水溶性染料已通过美国EPA安全认证，废物可直接倒入下水道，不会造成任何环境污染。

其特点是：
1）灵敏度高：GelRed和GelGreen是市场上灵敏度最高的凝胶核酸染料之一；
2）稳定性佳：可微波炉加热，可常温保存；
3）更安全：艾姆斯测试结果表明该染料的致突变性远小于溴化乙锭（EB）；
4）适应性广：适用于预制胶和胶后电泳染色；
5）染色过程简单：与EB一样，无需担心预制胶和电泳过程中染料降解；电泳后染色过程仅需30分钟，无需脱色或水洗；
6) 对DNA和RNA迁移影响小：对核酸迁移影响比SYBR Green I?小；
7）与标准凝胶成像系统和可见光激发的凝胶观察装置兼容：使用312nm激发的UV凝胶成像系统时，GelRed可以替代EB； GelGreen 足以替代凝胶观察装置中的任一 SYB 染料。然而，这种染料会使小 DNA 片段迁移得更慢（与 EB 相比）。

4. 黄金观 I/II

Goldview对于大的DNA片段有很好的染色效果，但是对于500bp以下的片段则不太好。另一个致命的弱点是它的荧光团在紫外光下很容易猝灭，通常需要5-10分钟。会消失。 Goldview 也不适合胶水回收。 Goldview实际上是AO（吖啶橙，剧毒产品），其荧光效果远不如EB，灵敏度差，底色严重，不适合回收，不稳定，在紫外光下诱导突变的能力较差高。

5. SYBR Green 和 SYBR Gold

稳定性差，毒性大。属于花青素核酸染料。花青素染料并非无毒，只是低毒。电泳等级已修改。改性有以下三种： 1.添加卤素或氰基。 2.插入环状羟基。 3、添加稳定剂。 SYBR Green I 是一种高灵敏度 DNA 荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单：无需脱色或洗涤。至少可以检测到20pg DNA，比EB染色高25-100倍。当SYBR Green I与双链DNA结合时，荧光信号将增强800-1000倍。 SYBR Green I 染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低。 SYBR Green 和 SYBR Gold 的稳定性远不如 EB。SYBR系列染料还可进入细胞对细胞核中的线粒体和DNA进行染色，造成伤害。 SYBR Green I已被证明在紫外线照射下具有很强的诱变能力，使DNA或其他物质发生突变。 （您也可能对。。。有兴趣荧光染料示例和应用）

这些常用的标注工具你用过吗？

抗体或蛋白质标记是指将目标物质（酶、荧光素、生物素）与抗体或其他蛋白质共价连接，并与生成测试物质发生特异性反应，形成多重复合物。借助荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜、发光免疫分析仪等精密仪器，可通过显微镜直接观察检测结果或在细胞、亚细胞、超微结构、分子水平上自动测定检测结果。对抗原和抗体反应进行定性和定位研究，或应用各种液相和固相免疫分析方法定性和定量测定体液中的半抗原和抗原。现在，抗体标记技术已广泛应用于医学病理学、免疫组织化学、分子生物学、生物制药等领域的分析研究和技术测定。常见的抗体标记技术包括酶标记、生物素化标记和荧光素标记。

常用的抗体/蛋白质标记技术

1. 酶标记

通过合适的方法将酶与抗体或蛋白质共价键合，制成酶标记抗体。然后，通过酶对底物的特异催化作用，生成有色不相容产物或具有一定电子密度的颗粒。这些有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察。也可以用分光光度计来测量。颜色反应表明酶的存在，证明相应的免疫反应已经发生。

蛋白质-蛋白质缀合通常使用双功能接头交联剂进行。交联剂（NHS酯）的一端与氨基酸赖氨酸和N端的胺（-NH2）反应，另一端（马来酰亚胺胺）与硫醇基（-SH）反应存在于氨基酸中。然而，SMCC 修饰的蛋白质极其不稳定，并且通常会发生自身反应。

2. 生物素标记

亲和素和生物素可以与蛋白质（抗原、抗体、酶）、荧光剂和其他分子结合，而不影响后者的生物活性。是一种理想的标记剂。一个抗体分子可与数十个生物素或亲和素分子偶联，亲和素或生物素分子可与酶或荧光素结合形成生物放大系统，显着提高检测的灵敏度。常用的有亲和素-生物素标记法、亲和素-生物素桥法、亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法。

3. 荧光标记

染料与蛋白质的结合需要染料与蛋白质之间形成稳定的共价键，并且这种共价键在大多数情况下都不能断裂。与蛋白质固有的荧光相比，小型有机染料在选择标记位点和增强荧光方面具有更大的灵活性，已广泛应用于蛋白质标记。用适当的荧光染料标记后，蛋白质可以在各种生物过程中可视化，以便可以在生化测定中量化或定位在细胞研究中心。染料-蛋白质缀合物已成为研究酶活性、蛋白质相互作用、构象变化以及调节和观察特定生物过程的非常重要的工具。它们已广泛应用于 ELISA、蛋白质印迹、流式细胞术和细胞成像。