转谷氨酰胺酶抗体与麸质敏感性的神经系统表现

对谷蛋白的敏感性可能会出现神经系统问题，小脑性共济失调是最常见的表现，被称为谷蛋白共济失调（GA）。GA是最常见的免疫介导的共济失调。高达60%的GA患者在小肠活检中没有肠病（乳糜泻-CD）的证据，但此类患者对无麸质饮食有反应（Hadjivassiliou等人，2013年）。最初，谷蛋白共济失调的诊断被认为是针对麦醇溶蛋白（抗谷蛋白抗体，AGA）抗体血清学阳性的那些患者。在对麸质敏感的患者中，抗球蛋白IgA/IgG的全身水平似乎反映了麸质引发的免疫反应，包括无麸质饮食后临床改善反应的降低。然而，这些血清学试验的特异性相对较低，由于开发了更特异的第二代抗脱酰胺醇溶蛋白肽和抗TG2 IgA试验用于CD诊断，AGA试验的可用性现在受到限制。此外，大多数AGA检测的阳性临界值是基于对CD患者的检测，因此仅适用于CD诊断，这意味着只有熟悉相关局限性的内科医生/神经科医生才能使用此类检测诊断GA。

对麸质的敏感性会导致全身性免疫介导的疾病，该疾病可表现为多种症状（肠道、皮肤、大脑）。除了强的谷蛋白特异性T细胞反应外，谷蛋白相关疾病（GRD）的另一个标志是对一种或多种转谷氨酰胺酶（TG）同工酶的强烈自身抗体反应。TG-谷蛋白肽复合物的形成允许携带TG-特异性IgD的B细胞摄取并随后呈递与MHC复合的谷蛋白肽，从而允许B细胞在缺乏TG-特异性T细胞的情况下活化和分化。已证明谷蛋白肽与催化过程中形成的活性位点Cys残基的稳定硫酯复合物在此过程中起作用，并且此类复合物确实由GRD开发出自身抗体的所有TG形成（Stamnaes等人，2010年）。

在具有神经缺陷的患者中，免疫反应偏向TG6（Hadjivassiliou等人，2008）。大多数现有证据与小脑性共济失调有关，但致病性抗体可能导致一系列神经系统疾病，包括共济失调伴肌阵挛、谷蛋白脑病（头痛伴白质异常，有时伴有血管性痴呆）（Hadjivassiliou等人，2010年）。神经缺陷和GRD之间联系的证据有三个方面。首先，抗TG6抗体的产生是谷蛋白依赖性的，这证实了与谷蛋白特异性T细胞群的联系（Hadjivassiliou等人，2013年）。其次，在循环抗TG6抗体的CD患者中，特定脑区的改变显而易见，这为脑缩小和TG6自身免疫之间的联系提供了证据（Hadjivassiliou等人，2019年）。第三，与抗TG3自身抗体和疱疹样皮炎类似，在动物模型中通过抗体进行的疾病被动转移直接暗示了这些疾病的发病机制（Boscolo等人，2010年）。TG6表达确实与中枢神经系统中的神经发生有关，TGM6基因突变与脊髓小脑共济失调35的关联强烈表明了该酶在神经元控制运动功能中的作用（Thomas等人，2013；Tripathy等人，2017年）。分子建模和生化分析表明TG6受Ca的变构调节2+并且疾病相关突变损害了酶功能的调节（Thomas等人，2013）。尽管通过不同的分子机制，但受损的酶折叠和功能似乎对神经元存活有影响（Tripathy等人，2017年）。

TG6自身抗体的检测不仅有助于神经性疾病学背景下GRD病的诊断，而且对已确诊的乳糜泻患者进行TG6循环抗体筛查可能有助于识别有神经系统问题风险的患者。越来越多的证据表明，TG6（以及TG3）的循环抗体是肠外疾病的前奏，通常在任何表现变得有症状之前很久就可以检测到（Hadjivassiliou等人，2020年）。

抗体验证的优越策略：封闭肽验证

据报道，每年因劣质抗体造成的生物和医学研究损失约为8亿美元。此外，实验结果不一致和抗体重复性差的后果 是无法估计的。

国际抗体验证工作组（IWGAV）于2016年9月发表题为《 自然方法 中 抗体验证的建议》的文章 ，强调抗体验证应根据目标蛋白的相应应用和背景进行。作者提出了抗体验证的五个概念支柱：（i）遗传策略，（ii）正交策略，（iii）独立抗体策略，（iv）标记蛋白的表达，以及（v）免疫捕获后进行质谱分析。多发性硬化症）。

这五种方法各有其优缺点以及适用条件。例如，遗传策略通过比较细胞或组织中的相关信号来评估抗体特异性，其中使用 CRISPR-Cas9 或 RNA 干扰 (RNAi) 敲除或敲低目标基因与野生型 (WT) 对照的信号。尽管这种方法很简单，但未能击倒或敲除目标基因将大大损害该方法的实验可行性。

免疫捕获后进行质谱 (MS) 的方法可以识别与纯化抗体直接相互作用的蛋白质， 以及与目标蛋白质间接相互作用的其他蛋白质。 然而，这种方法依赖于昂贵的科学仪器和实验材料。并非每个实验室都能负担得起这些设备。

在 Affinity Biotech，抗体通过 独立抗体验证进行验证。为此，使用几种抗体来识别靶蛋白上的不同表位。具有最高特异性的抗体是通过包括比较和定量分析的适当程序确定的。虽然大多数抗体的检测应该没有问题，但对于检测特异性要求较高的抗体，特别是那些位点特异性的磷酸化抗体，仍然不够。

结合多年的抗体研发和生产经验，Affinity Biotech采用了更合适的抗体验证策略： 封闭 肽验证。

封闭肽(抗原)与抗体一一对应。 。这是最原始的材料，只有原厂才能提供。

首先，我们对封闭肽进行 MS 分析，以确保肽序列准确。

在蛋白质印迹分析中，肽会阻断目标抗体的信号。没有封闭肽的泳道用作对照。封闭肽将与靶蛋白竞争结合位点，从而在封闭基团中不留下特异性条带。

该策略目前用于验证我们的抗体。它对于磷抗体的生产至关重要，因为它确保了磷抗体的位点特异性。换句话说，磷酸化抗体只能识别相应位点的磷酸化靶蛋白。非磷酸化的目标蛋白或其他位点磷酸化的目标蛋白将不会被识别。

举个例子。在 Phospho-MSK1 (Ser211) Antibody（货号 AF7155）的蛋白质印迹验证中，泳道 1 和泳道 3 中分别添加了非磷酸化阻断肽和磷酸化阻断肽。 2号车道没有被封闭。结果显示，使用磷酸化肽封闭目标蛋白后，没有检测到目的条带。

哪种类型的抗体适合我？

对于大多数实验室来说，正确的决定取决于科学和成本的某种结合。需要考虑的一些问题是：

您需要多少材料以及需要多长时间？

早期探索型项目可能只需要有限数量的材料，或者您的工作流程可能一次仅使用几微克的抗体。利用多克隆生成对于这些情况非常有效。兔子是多克隆抗体的行业标准，因为它具有强大的免疫系统，并且可以根据需要灵活地一次生产多年的抗体。如果您需要预先大量的材料而不是长期使用，那么对较大的动物（例如山羊）进行免疫可能会有所帮助。 

然而，如果您正在尝试生产用于有可能无限期使用的检测的试剂，那么单克隆生产可能更理想。

抗体的活性是否必须始终相同，或者某些批次间的差异在您的系统中是否可行？

通过多克隆生产，动物得到免疫，您的测试物品就成为最终收集到的一切。随着时间的推移，反应可能会发生变化或成熟，但可以通过在检测中使用一致量的抗体来减轻这种情况。 

同时，单克隆生产的明确目的是执行多个筛选步骤，以找到表达适合您的检测反应的抗体的单个细胞系。只要能够保持稳定性，该细胞系就应该能够在您需要时表达抗体。最终一致性的最终保证是对抗体的可变区进行测序并将其生产为重组蛋白。 

该项目有时间限制吗？

多克隆项目平均需要三个月的时间，而分离出具有所需性能的特定单克隆细胞系可能需要六个月的时间。此后生产重组蛋白形式的抗体可能还需要三个月或更长时间。 

您是否已经拥有希望与新生成的材料并行使用的现有抗体？

无论您当前拥有的抗体是多克隆还是单克隆，请选择不同的物种来开发第二抗体。这样您就可以用单独的二抗进行探测并同时查看两种反应性。例如，在鸡、山羊或豚鼠中制备多克隆是最常选择与现有兔抗体并行使用的选项。 

您的预算是多少？

由于固有的成本效益（平均单克隆成本约为平均多克隆成本的六倍），同时多种抗体的高通量需求很可能会利用多克隆生产。然而，对于早期诊断或治疗，以单克隆项目开始可能会更好地满足您的整体需求，并在项目加速方面带来红利。

单克隆抗体应用

抗体是免疫系统中有价值的蛋白质成分，其对目标物质的特异性将其用途扩展到诊断和治疗领域。尽管单克隆和多克隆抗体处于科学创新的前沿，但它们有许多优点和缺点，使它们更适合某些应用而不是其他应用。

在医学进步中，单克隆抗体已成为“个性化治疗”方面的明星。早在 1796 年，著名的爱德华·詹纳 (Edward Jenner) 博士就开始使用间接抗体疗法，从天花病变处取出脓疱液并接种到健康个体，以产生免疫反应。科学家已进一步利用这种自然免疫机制用于治疗和诊断目的。

可以人工制造针对患者体内任何所需疾病病原体或分子的特异性抗体。 1975 年，Kohler 博士和 Milstein 博士确立了 mAb 在人类中的应用，使用杂交细胞（由脾 B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞组成）产生大量单一抗体克隆，其特异性已预先选择。

单克隆抗体现已广泛应用于医学、疫苗以及用于输血等目的的血型和组织检测。当用作研究探针时，它们有利于癌症、神经系统和自身免疫性疾病的病理学诊断和研究。它们甚至被用于治疗与年龄相关的黄斑变性、多发性硬化症、哮喘和骨质疏松症。希望通过进一步的研究，单克隆抗体可能在治疗阿尔茨海默病、偏头痛和糖尿病方面发挥重要作用。

在研究、诊断和治疗中使用 mAb 最有利的是，它们与单个表位结合，比 pAb 提供更高的特异性和更高的亲和力。这使得它们在调查或针对翻译后修饰等细节时成为一种资产。此外，它们的批次重现性使它们更适合需要监管批准的科学领域。另一方面，单克隆抗体的设计和制造成本高昂、耗时，并且需要高水平的专业知识。尽管如此，它们在医学中的积极作用也许可以克服这些缺点。

单克隆抗体在肿瘤学中的应用

可以说，单克隆抗体通过在抗体药物缀合物中的使用而改变了肿瘤学领域，其中它们通常与生物活性剂缀合。单克隆抗体的特异性意味着它们可以直接将药物分子或在癌症情况下将细胞毒剂递送至受感染细胞的靶点。抗体-药物偶联物已成功地提供了癌症治疗的替代方案，例如甲氨蝶呤等小分子化疗药物，其目标是健康细胞和癌细胞。目前，许多 ADC 正处于临床试验阶段，其中许多已获得 FDA 批准，例如用于治疗霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤的 Brentuximab vedotin (Adcetris®) 和针对 HER2 的曲妥珠单抗 emtansine (Kadcyla®)。阳性转移性乳腺癌。Biosynth 提供了一种新颖的连接技术，称为 CTAT™技术，用于生产此类抗体-药物缀合物。

我们的连接技术 CTAT™ 使用 CTAT™ 酶将选定的有效负载分子连接到抗体、抗体片段或蛋白质上的特定位点。该有效负载分子可以是治疗药物分子，如珠子、基质或染料。 使用表达质粒将 3-4 个氨基酸的特定序列插入抗体中。然后该序列被 CTAT™ 酶识别并“切割”，最终将该分子与选定的抗体或蛋白质共价连接。