如何收集唾液：动物的唾液收集方法和装置

唾液中的生物标志物越来越多地被用来监测动物的健康和福祉（例如，唾液皮质醇和狗的压力），这项技术不断为研究人员提供在许多生物行为研究中获得有效、一致和可重复结论的机会。第一批技术，如棉绳、棉签、垫、唾液腺、水解纤维素海绵和其他装置，已用于收集鹿、豚鼠、狗、马、灵长类动物和其他动物物种的唾液 (29-36)。然而，最新的唾液收集设备技术和收集方案显着减轻了与以前的收集方法相关的负担。

Salimetrics 推荐 SalivaBio 的婴儿和儿童拭子设备作为从口腔直径 8 毫米及以上的动物采集唾液的有效方法，以提供舒适、安全的唾液采集。

SalivaBio 拭子用于动物唾液采集的优点：

• 舒适、无毒的收藏

• 抗撕裂

• 快速、毛细管作用收集

• 1-2mL容量（取决于设备）

• 无窒息危险（由技术人员安全握住时）

成功采集动物唾液的技巧：

• 用棉签“轻拍”唾液聚集的区域，而不是试图擦拭唾液

• 缓慢引入拭子，在采集前训练动物

• 对于某些研究，拭子已用简单的溶液调味以协助样本收集（建议进行试点研究）

• 使用“延伸范围”设备（杆、棍等）通常用于收集非驯养动物的唾液

小动物：科学文献包含对小鼠和大鼠唾液采集技术的各种描述，例如毛细管、滤纸条、塑料移液器和更复杂的抽吸装置。然而，Salimetrics & SalivaBio 没有此类方法的直接经验，因此无法就其使用提供建议。

传代方法的概述

传代方法概述

1.消化传代：

        弃去培养基，PBS润洗一次后加入适量胰酶晃匀（以盖住细胞表面为宜），放入培养箱消化。细胞呈斑片状时加入等体积新鲜全培养基终止消化。吹打细胞后转移悬液至洁净离心管，600g离心5分钟。弃去上清，用新鲜培养基重悬细胞至培养瓶，补足培养液体积，移入培养箱培养。

2.直接传代：

         用吸管吸取细胞悬液的1/2～1/4至另一瓶中；加入适量的新鲜培养基，补足培养液体积，培养箱继续培养。

3.离心传代：

         将细胞悬液转移至离心管内，600 g 离心 5 min，弃去上清。使用新鲜的培养基重悬细胞至新的培养瓶，补足培养液体积，培养箱继续培养。

细胞冻存注意事项

细胞冻存步骤：

使用上述传代步骤至离心后，弃去培养基，用600μL~1mL冻存液重悬细胞后，转移细胞至冻存管。

无血清冻存液可直接冻于-80，否则采取梯度降温法冻存。

含血清冻存液成分：20％FBS、10％DMSO、70％1640培养液

细胞冻存需注意：

● 细胞数量过少可能导致复苏困难，应至少有5*105。

● 冻存时应处于对数生长期，状态不佳的细胞复苏困难。

● 尽量采用梯度降温并使用梯度降温盒。

● 冻存的细胞不可直接移入液氮，应-80冻存超过6小时后再液氮冻存。

● 冻存和复苏的时间间隔不宜过短，不可小于三天。

小分子药物聚乙二醇化方法

聚乙二醇(PEG)是乙二醇的聚合物，相对分子质量为200～8000或以上。由重复的乙氧基组成，不仅具有良好的水溶性，而且易溶于苯、乙腈、乙醇等有机溶剂。 PEG分子的特点如下：

①低分散性：相对分子质量（Mr）小于5000的分散性为1.01，分子量（Mr）大于5000的分散性为1.1，具有较宽的范围。分布和更大的选择性；
②两亲性：既溶于有机溶剂又溶于水；
③无毒：研究表明大于1000的聚乙二醇无毒，已用于各种食品、化妆品和药品中；
④ 可生物降解：聚乙二醇在体内直接消除，结构不发生任何变化。分子量小于20000的代谢物可以通过肾脏代谢，较大分子可以通过消化系统代谢。

聚乙二醇化药物的特点

大多数蛋白质药物、多肽药物、化学药物都伴有一些自身无法克服的问题，如作用时间短、免疫原性大、副作用大等。 PEG呈中性、无毒，具有很好的理化性质和良好的生物相容性，是美国FDA批准用于体内注射药物的少数化学品之一。因此，通过化学方法将活化的聚乙二醇与蛋白质、肽、小分子药物和脂质体连接，即对药物分子进行聚乙二醇化，可以有效提高药物分子的生物半衰期，降低其毒副作用。可以减少影响。其中，研究最多的是蛋白质的PEG修饰。与未修饰的蛋白质药物相比，聚乙二醇化的蛋白质药物具有以下优点：

（1）生物活性更强；
（2）脂质体对肿瘤有更强的被动靶向作用；
(3)较长的半衰期；
(4)降低最大血药浓度；
(5)血药浓度轻微波动；
(6)酶促降解少；
(7)免疫原性和抗原性较低；
(8)毒性较小；
(9) 溶解性更好；
(10)减少用药次数；
(11)提高患者依从性，改善生活质量，降低治疗费用。

聚乙二醇化方法

鉴于聚乙二醇化对药物性质的巨大影响，聚乙二醇化已成为药物开发和提高已上市药物疗效的重要途径。因此，如何进行PEG化就成为重中之重。

首先，需要选择合适的PEG进行分子修饰。修饰剂的选择主要考虑以下5个方面：

（1）选择PEG相对分子质量（Mr）的确定应同时考虑生物活性和药代动力学因素。应用太大的聚乙二醇化蛋白药物会导致药物失去大部分生物活性。当使用低Mr（<20000）聚乙二醇化蛋白质药物时，修饰后的蛋白质药物与原型药物相比，生物活性和药代动力学性质没有本质变化。因此，一般选择40000-60000范围内的PEG作为修饰。
(2)修饰位点的选择应基于对蛋白质构效关系的分析。选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点，使得修饰后的蛋白质能够保留较高的生物活性。常见的修饰位点有氨基修饰、羧基修饰和硫醇修饰；
(3) PEG修饰剂与氨基酸反应的特异性取决于修饰剂的化学性质和修饰位点的选择。
(4)PEG修饰剂的水解稳定性和反应活性取决于活化基团的稳定性和修饰反应条件尤其是pH值的控制。一般来说，PEG修饰剂反应活性高，因此稳定性较差，容易水解；
(5)聚乙二醇化蛋白的活性、毒性和抗原性与聚乙二醇修饰的大小和类型有关。一般情况下，随着PEG相对分子量的增加，蛋白质活性的损失逐渐增加。此外，不同的PEG修饰剂对蛋白质生物活性的影响也不同。

其次，激活PEG。聚乙二醇化蛋白质主要是通过PEG末端羟基与蛋白质氨基酸残基反应实现的。 PEG末端羟基活性较差，必须用活化剂活化才能在体内温和条件下共价修饰蛋白质。常见的PEG活化方法有：

(1)羰基二咪唑法：该方法首先用于多肽的合成，并已被证明是形成酰胺键的良好试剂。

(2)N-羟基琥珀酰亚胺法： (a)活化N，N-琥珀酰亚胺碳酸酯。该反应需要在无水条件下进行。 (B) 活化琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺。该方法得到的聚乙二醇具有较高的活性。最好在非水环境中进行蛋白质偶联。

N,N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的 PEG


琥珀酸酐和 N-羟基琥珀酰亚胺活化的 PEG

(3)氰尿酰氯法：氰尿酰氯又称三氯嗪(TST)，是一种对称杂环化合物。 David 使用 TST 与聚乙二醇上的羟基发生反应。只有一个氯原子被取代，其他氯原子与蛋白质氨基反应。

(4)光气活化法：Kurfuerst提到了由N-羟基琥珀酰亚胺钾盐、硝基苯酚、三氯苯酚与光气反应制备活化聚乙二醇的方法。激活分为两个步骤，如下图所示。

(5)聚乙二醇对蛋白质半胱氨酸残基进行化学修饰。磺基特异性修饰的常见PEG活化方法如下图所示。

(6)连接酶位点的聚乙二醇：除了传统的化学修饰方法外，还可以通过酶催化等其他方式实现修饰，以G-TGase为例。

最后选择合适的蛋白质氨基酸残基位点或小分子药物位点进行位点特异性修饰。用活化的PEG对合适的蛋白质氨基酸残基进行位点特异性修饰可以提高天然蛋白质的功效。蛋白质药物PEG修饰技术最大的问题是无法实现位点特异性修饰，修饰产物不均一，给分离纯化带来很大困难，也极大阻碍了临床应用。根据蛋白质的氨基酸性质和PEG衍生物的特点，科学家在使用PEG进行修饰时，选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点。这样，修饰后的蛋白质药物除了具有聚乙二醇化带来的优异性能外，还具有较高的生物活性。目前上市药物中常见的修饰位点包括氨基、羧基、磺基、二硫基、糖基以及非极性氨基酸的一些特定位置。

氨氮快速检测方法

免疫测定的方法有哪些？

利用抗原和抗体的特异性结合特性，通过免疫分析技术可以对细胞因子进行定量或定性检测。尽管细胞因子的种类很多，但只要获得针对细胞因子的特异性抗体（包括多克隆或单克隆抗体），就可以采用免疫分析法进行检测。常用的方法包括ELISA、RIA、Western blotting、免疫荧光以及基于免疫荧光技术的流式细胞术分析。

1. 酶联免疫吸附法

ELISA是应用广泛的异质酶标记免疫分析技术。一步或多步抗原抗体反应和一步酶促反应构成了ELISA的基本步骤，可用于定性或定量分析。双抗体夹心法是细胞因子测定常用的方法。该方法中使用的抗体可以是针对同一抗原的多克隆抗体或针对同一抗原的不同表位的单克隆抗体。

细胞因子测定的标本主要包括两类，一类是血清（血浆）、滑液、胸水、脑脊液或腹膜液等体液，可用于细胞因子和可溶性粘附分子的检测；另一种是体外培养后的细胞培养。上清液仅用于细胞因子的检测。

ELISA方法具有特异性强、简便、易于推广和标准化等优点。此外，该方法还可以检测无生物活性的细胞因子前体、分解片段以及与相应受体的缀合物。缺点是灵敏度较低，无法判断细胞因子的生物活性。

2. 流式细胞仪

流式细胞术是一种基于荧光抗体染色技术和流式细胞术灵敏分辨率的方法。该方法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测。通过特异性荧光抗体染色，可以简单快速地进行单细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，并且可以准确确定不同细胞亚群的检测。细胞因子和膜分子的表达。根据荧光抗体的性质，荧光抗体染色可分为直接法和间接法。前者使用荧光标记的细胞因子或粘附分子的特异性抗体，而后者则使用荧光标记的二抗。直接法较为常用，虽然其灵敏度不如间接法，但特异性强。

该方法检测细胞内细胞因子时，主要包括以下基本步骤：

1. 待测细胞的分离和培养

2. 细胞固定常用的细胞固定液为4%多聚甲醛。

3. 封闭非特异性结合位点 用含有 5% 脱脂奶粉和钙、镁离子的 PBS 溶液重悬固定的细胞。

4.染色与分析采用荧光素标记的细胞因子特异性单克隆抗体进行荧光抗体染色，流式细胞仪分析荧光阳性细胞百分率和荧光强度。另外，如果使用两种或多种细胞因子的不同荧光素标记的单克隆抗体，则可以同时检测同一细胞中两种或多种不同的细胞因子。

该方法还可用于区分具有不同分泌特性的细胞亚群，例如 Th1 和 Th2 细胞。

3.酶联免疫斑点法

酶联免疫斑点试验（ELISPOT），源自ELISA，但突破了传统ELISA，是抗体形成细胞定量测定的延伸和发展，已越来越多地应用于类风湿因子、IFN-γ等细胞因子的定量测定的分泌细胞。

ELISPOT优于传统的抗体、细胞因子或其他可溶性分子分泌细胞检测方法，可以检测20万至30万个细胞中1个分泌相应分子的细胞。如果引入生物素和亲和素系统，则很敏感。做ELISPOT时，所选的特异性抗体应具有高亲和力、高特异性、低内毒素的特点。所选的细胞激活剂不得影响细胞的分泌功能。

4. 免疫测定的方法学评价
免疫测定可用于检测几乎所有细胞因子。与生物活性测定相比，主要优点和缺点是：

优点：①特异性高，使用特异性单克隆抗体可用于单一细胞因子的检测； ②操作简单、快速，不需要依赖细胞系，因此不需要维持培养，大大增加了方法的可操作性，易于普及，便于普查； ③影响因素相对较少且易于控制，重复性好，方法易于标准化。

缺点：①测量的只是细胞因子的蛋白质含量，与其生物活性不一定成正比； ②测定结果与所用抗体的来源和亲和力有很大关系。当使用具有不同亲和力的mAb时，检测到相同的样品。结果可能会有所不同； ③灵敏度较低，比生物活性法低10～100倍左右，测定下限一般为100pg； ④ 如果样品中存在可溶性细胞因子受体，可能会影响细胞因子特异性抗体的结合。

除了上述方法外，分子生物学技术（也是生物测定方法）也广泛应用于细胞因子或粘附分子的检测，例如PCR/RT-PCR、斑点印迹、Northern-blot和FISH。细胞或组织原位杂交等

其他免疫分析：偏振荧光检测技术；使用共焦激光显微镜；发光技术；免疫组织化学染色。这些方法在粘附分子、细胞因子及其分泌细胞的检测中发挥着积极的作用。

代谢组学数据的统计分析方法和策略

代谢组学数据的统计分析方法和策略

获得代谢组学数据后，需要利用软件读取并分析原始数据的信息，以确定原始数据中所含代谢成分的组成和含量。有许多统计软件可以读取和分析核磁共振谱和质谱数据。 XCMS 是一款常用的免费软件，用于读取和分析质谱原始数据。类似的常用软件还有MZmine2、MetAlign、MathDAMP、LCMStats等。

一旦获得代谢物组成和含量，就可以对这些数据进行统计分析。常用的分析方法包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘回归、聚类分析、差异表达分析等。结果还可以利用上述数据库进行功能和通路富集分析。

成功传代的方法——解离法

在开发特定细胞系的培养条件时需要考虑许多参数。我们都知道 pH 平衡、氧气水平和血清浓度是影响培养成败的重要变量。然而，包括与细胞需求相匹配的解离方法的传代方案也同样重要。考虑到这一点，我们将回顾一些常见解离实践背后的原则，以帮助您根据细胞系的具体性质定制方法。

悬浮生长的细胞易于传代培养。只要在细胞耗尽营养供应之前将细胞稀释到合适的新鲜培养基中，它们就会表现得很好。另一方面，单层生长的细胞彼此之间以及与培养皿之间形成蛋白质接触。在将细胞悬浮在培养基中、离心并重新铺板之前，必须先将这些物质破坏。因此，必须特别考虑以确保解离条件破坏细胞接触而不杀死细胞。

胰蛋白酶有时（但并非总是）是答案

在决定解离条件时，研究者应考虑细胞形成的键的类型。一些贴壁细胞系仅形成微弱的接触，只需将培养瓶敲击手掌或将培养瓶敲击台面即可破坏接触。其他贴壁细胞系，特别是那些源自上皮的细胞系，会形成牢固的多蛋白紧密连接，只能通过酶消化来破坏；在这些情况下，通常使用胰蛋白酶（一种丝氨酸蛋白酶）。源自上皮的细胞还可以表达钙粘蛋白，其介导非常强的钙依赖性粘附或桥粒连接。在这种情况下，可能需要添加钙螯合剂（如 EDTA）来隔离钙，以有效地解离细胞。

优化解离后的活力

为了优化解离后的细胞活力，反应条件应与细胞接触的强度相匹配。例如，如果标准胰蛋白酶/EDTA 消化（通常为 0.05%-0.5%）不能有效消化细胞键（10-15 分钟内），则可能很难在细胞开始死亡之前将其从平板上移除，并且细胞活力也会受到影响。将会受到不利影响。在这种情况下，可能需要更高浓度的胰蛋白酶/EDTA 或其他酶，例如胶原酶。另一方面，如果反应过于剧烈，细胞可能会裂解或失去重新附着到平板上所需的表面蛋白，这两种情况都会导致活力降低。此外，裂解的细胞会释放基因组 DNA，导致活细胞聚集，使存活细胞更难重新铺板，因此需要添加 DNase。

准备是良好解离的关键

如果您已将反应强度与细胞系的粘附特性相匹配，但您的细胞仍然难以去除，您可能会发现问题在于细胞准备解离的方式。生长培养基中可能存在抑制胰蛋白酶的成分，例如血清，但这可以通过简单地用Dulbecco PBS冲洗细胞一到两次来克服 （不含钙或镁）在添加解离试剂之前。也可能是细胞保持汇合的时间太长。在这些条件下，细胞可能会形成异常牢固的细胞-细胞和细胞-表面连接，并且异常难以破坏。出于这个原因，以及为了培养物的整体健康，建议细胞在达到 100% 汇合（即 70-90% 汇合）之前进行传代。

结论

有了对解离试剂如何工作的基本了解，研究人员可以开发一种优化的方案，同时考虑细胞粘附特性的强度和质量。细胞解离的优化方案将确保成功传代并延长细胞在培养物中的寿命。

蛋白质分离纯化的方法

研究最终取决于群体的表达产物。无论是用于检测还是用于棉花保护，表达的蛋白都需要分离纯化。但蛋白质的性质不同，所以方法也不同。

蛋白质的一级、二级、三级、四级结构决定了其物理、化学、生化、物理、化学、生物性质。此外，它总结了不同蛋白质性质的差异或改变条件使它们不同。同时利用多种性质，在兼顾产量和纯度的情况下，选择蛋白质纯化的方法。

蛋白质一般以复杂混合物的形式存在于组织或细胞中，每种细胞毒性都包含数千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和纯化是一项艰巨的任务。蛋白质纯化的总体目标是力图提高产物的纯度或比活性，要求纯化合理、快速、得率高、纯度高。并将蛋白质从细胞中的其他所有成分中分离出来，特别是不需要的不纯蛋白质，同时仍然保留肽的生物活性和化学完整性。

之所以能从数千种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质，是因为不同的蛋白质具有截然不同的物理、化学、理化和生物特性。

这些性质是由蛋白质的氨基酸序列和数量不同造成的，连接在多肽主链上的氨基酸残基是带正电的、带电的、极性的还是非极性的、亲水的还是疏水的。

此外，多肽还可以折叠成非常确定的二级结构（α螺旋、β折叠和各种角度）、三级结构和四级结构。利用待分离蛋白质与其他蛋白质性质的差异，在蛋白质表面形成一定大小、形状和分布的残基，并设计一套合理的分级分离步骤。

蛋白质混合物可以根据蛋白质不同性质对应的方法进行分离：

1 分子大小

不同类型的蛋白质在分子大小上有一定的差异，可以采用一些简单的方法使蛋白质混合物得到初步分离。

1.1 透析和超滤

透析在纯化中非常常用，可以去除盐（脱盐和置换缓冲液）、有机溶剂和低分子量抑制剂。透析膜的截留分子量约为5000。例如，分子量小于10000的酶溶液可能会泄漏。超滤一般用于浓缩和脱色。

1.2 更换缓冲液的离心分离

许多酶富含于某种细胞器中。匀浆后，通过离心得到某种亚细胞成分，使酶富集10-20倍，然后纯化出特定的酶。差速离心，分辨率低，仅适用于粗提取或浓缩。

速率分区，如果离心时间太长，所有物质都会沉淀。因此，需要选择最佳的分离时间，以获得相当纯的亚细胞成分进行进一步纯化，避免差速离心中大、小成分的沉淀。但容量较小，只能少量使用。

密度梯度离心常用的介质包括蔗糖、聚蔗糖、氯化铯、溴化钾和碘化钠。

1.3 凝胶过滤

这是根据分子大小分离蛋白质混合物的有效方法之一。注意待分离蛋白质的分子量在凝胶的工作范围内。选择不同分子量的凝胶可用于脱盐、更换缓冲液以及利用分子量差异去除热源。

2 形状

当蛋白质在离心过程中穿过溶液时，或者当它们穿过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔时，蛋白质会受到其形状的影响。

对于相同质量的两种蛋白质，环状蛋白质的有效半径（斯托克斯半径）较小。通过溶液沉降时遇到的摩擦力很小，沉降速度更快，并且比其他形状的蛋白质显得更大。相反，在尺寸排阻色谱中，斯托克半径较小的球状蛋白质更容易扩散到凝胶过滤填料颗粒内部并随后洗脱，因此它们看起来比其他形状的蛋白质更小。

3 溶解度

利用蛋白质溶解度的差异来区分各种蛋白质的常用方法。影响蛋白质溶解度的外界因素有很多，其中主要的有：溶液pH、离子强度、介电常数和温度。但在相同的特定外部条件下，不同的蛋白质具有不同的溶解度。适当改变外部条件来控制蛋白质混合物中某种成分的溶解度。

3.1 pH控制和等电点沉淀

蛋白质在等电点通常溶解度较低。

3.2 蛋白质的盐腌和盐析

3.3 有机溶剂分类方法

蛋白质在不同溶剂中的溶解度差异很大，从基本不溶（<10μg/ml）到极易溶解（>300mg/ml）。影响蛋白质溶解度的可变因素包括温度、pH、溶剂极性、离子性质和离子强度。引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此可以控制有机溶剂的浓度来分离蛋白质。

水溶性非离子聚合物（聚乙二醇）也会引起蛋白质沉淀。

3.4 温度

不同的蛋白质在不同的温度下具有不同的溶解度和活性。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此分离操作一般在0℃或更低的温度下进行。

4 充电

蛋白质的净电荷取决于氨基酸残基携带的正电荷和负电荷的总和。例如，带有净负电荷的中性溶液称为酸性蛋白质。

4.1 电泳

它不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要方法，也是研究蛋白质性质的非常有用的方法。

等电聚焦分辨率非常高，pI可以以0.02pH的差异分离。

蛋白质 2D-PAGE 分离的分辨率已发展到 100,000 个蛋白质点。

4.2 离子交换色谱法

改变蛋白质混合溶液中的盐离子强度pH和(阴离子、阳离子)离子交换填料，不同蛋白质对不同离子交换填料的吸附能力不同，蛋白质因吸附能力不同或不被吸附而分离。

可以通过保持洗脱液组成恒定或通过改变洗脱液的盐度或pH来进行洗脱。后者又可分为分段洗脱和梯度洗脱。梯度洗脱一般效果好，分辨率高，特别是使用交换容量小、对盐浓度敏感的离子交换剂。控制洗脱液的体积（与柱床的体积相比）、盐浓度和pH，以及样品组分可以从离子交换柱中单独洗脱。

蛋白质分子外表面暴露的侧链基团的类型和数量不同，因此缓冲液在一定pH值和离子强度下的电荷也不同。

5 电荷分布

带电的氨基酸残基可以均匀分布在蛋白质表面，可以与适当强度的阳离子交换柱或与阴离子结合。由于大多数蛋白质不能在单一溶剂中与两种类型的离子交换柱结合，因此可以利用这种特性来纯化它们。带电的氨基酸残基还可以成簇分布，使得一个区域带强正电荷，另一区域带强负电荷，呈强酸性或强酸性。可与阳离子交换树脂或一定pH条件下的阳离子交换树脂结合使用。例如，钙调蛋白只能在 pH 2 时与阳离子交换树脂结合。

6 疏水性

大多数疏水性氨基酸残基隐藏在蛋白质内部，但也有一些位于表面。蛋白质表面疏水性氨基酸残基的数量和空间分布决定了蛋白质是否具有与疏水性柱填料结合用于分离的能力。

其价格低廉，纯化的蛋白质具有生物活性，是分离纯化蛋白质的通用工具。

高浓度盐水溶液中的蛋白质保留在柱上，并在低盐或水溶液中从柱上洗脱。因此，特别适合浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液，以及沉淀后含有目标产物的溶液用盐溶解后直接注入柱中。

7mol/盐酸胍或8mol/L尿素也适用于直接注入柱中的大肠杆菌蛋白提取物的处理，并且在复性的同时进行分离。

7 密度

大多数蛋白质的密度在1.3~1.4g/cm3之间。该特性通常不常用于蛋白质分级分离。

但含有大量磷酸盐或脂质的蛋白质的密度与普通蛋白质明显不同，因此大多数蛋白质可以通过密度梯度离心分离。

8 基因工程构建的纯化标记

通过改变cDNA，在表达蛋白的氨基端或羧基端添加少量额外的氨基酸，可以作为纯化的有效基础。

8.1 GST融合向量

待表达的蛋白与谷胱甘肽S-转移酶一起表达，然后用谷胱甘肽Sepharose 4B纯化，然后用凝血酶或因子Xa切割。

8.2 蛋白A融合载体

将待表达的蛋白与蛋白 A 的 IgG 结合位点融合在一起进行表达，并用 IgG Sepharose 进行纯化。

8.3（组氨酸标记）螯合琼脂糖凝胶

最常见的标记之一是在蛋白质的氨基末端添加6~10个组氨酸。在正常或变性条件下（8M尿素），借助其与Ni2+螯合柱紧密结合的能力，用咪唑洗涤去除或将pH降至5.9，使组氨酸全质子化，不再与Ni2+结合，使其纯化。

重组蛋白在设计和构建时已融入纯化概念。样品中大多混有破碎细胞或可溶产物。膨胀床吸附技术 STREAmLINE 适用于粗分离。

9 亲和力

兼具效率高、分离速度快的特点。配体可以是酶底物、抑制剂、辅因子和特异性抗体。

吸附后，可以改变缓冲液的离子强度和pH值来洗脱目标蛋白。也可用更高浓度的相同配体溶液或亲和力更强的配体溶液进行洗脱。

与超滤相结合，浓缩两者的优点，形成超滤亲和纯化，具有分离效率高、可大规模工业化的优点，适合初步分离。

根据配体的不同，可分为：

(1)金属螯合介质

过渡金属离子Cu2＋、Zn2＋、Ni 2＋ 以亚胺配合物的形式结合。由于这些金属离子与色氨酸、组氨酸和半胱氨酸形成配位键，从而形成亚胺金属-蛋白质螯合物，使得含有这些氨基酸的蛋白质被该金属螯合物亲和色谱的固定相吸附。螯合物的稳定性由单个组氨酸和半胱氨酸的解离常数控制，该解离常数还受到流动相的 pH 和温度的影响。控制条件可以将不同的蛋白质彼此分离。

(2) 小配体亲和介质

配体包括精氨酸、苯甲酰胺、钙调蛋白、明胶、肝素和赖氨酸。

(3) 抗体亲和介质

免疫亲和层析，配体为重组蛋白A和重组蛋白G，但蛋白A比蛋白G特异性更强，并且蛋白G可以结合更多不同来源的IgG。

(4)颜料亲和介质

染料色谱的效果主要取决于染料配体及其与酶的亲和力大小。它还与洗脱缓冲液的类型、离子强度、pH值和待分离样品的纯度有关。有两种配体：Cibacron Blue 和 Procion Red。在某些条件下，固定化染料可以充当阳离子交换剂。为了避免这种现象，最好在离子强度小于0.1、pH大于7时进行操作。

(5) 外源凝集素亲和介质

配体包括刀豆球蛋白、扁豆凝集素和麦芽凝集素。固相凝集素可以与多种碳水化合物残基发生可逆反应，适用于多糖和糖蛋白的纯化。

10 非极性群体之间的力量

流动相中的置换剂是极性比水小的有机溶剂，这些有机溶剂可能会导致许多蛋白质分子发生不可逆的变性。流动相中必须存在离子对试剂才能使分离有效并获得高质量回收率。分离必须在酸性介质中进行，而有些蛋白质在后两种条件下会产生不可逆的分子构象变化，因此人类在生物大分子中的分离纯化受到限制。

正相色谱法在生物大分子的分离纯化中应用相对较少，因为所用的溶剂非常昂贵。

11 可逆缔合

在一定的溶液条件下，有些酶可以聚合成二聚体、四聚体等，而在另一种条件下，则形成单体。

12 稳定性

12.1 热稳定性

大多数蛋白质在加热至 95°C 时会解折叠或沉淀。利用这种特性，在加热后保留其可溶性活性的蛋白质可以很容易地与大多数其他细胞蛋白质分离。

12.2 蛋白水解的稳定性

用蛋白酶处理上清液以消化受污染的蛋白质，留下对蛋白水解具有抗性的蛋白质。

13 分配系数

采用水相两相萃取分离，常用的生物材料分离系统有：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEXTRAN）、PEG/磷酸盐、PEG/硫酸铵等。由于其含水比高，所选用的生物材料分离系统有：聚合物和盐对酶无毒。而分离设备也应用于化工行业，在工业上受到重视。

开发：新型双水相分离技术有亲和双水相萃取、膜分离双水相萃取等。

14 表面活性

14.1 泡沫分离

蛋白质溶液具有表面活性，溶液中产生气体，气泡与液相主体分离并富集在塔顶，达到分离浓缩的目的。

14.2 反胶束相转移法

反胶束相转移法是80年代出现的一种新型分离技术。它利用表面活性剂分子在有机溶剂中自发形成的反胶束。在一定条件下，水溶性蛋白质分子溶解成反胶束。在极核中，创造条件将蛋白质萃取到另一个水相，实现蛋白质的相转移，达到分离纯化蛋白质的目的。

反胶束中的蛋白质分子受到周围水分子和表面活性剂极性头的保护，仍然保持一定的活性，甚至表现出超活性。据报道，AOT/异辛烷反相胶束用于酵母脂肪酶的相转移。

抗体和重组蛋白使用、保存方法

无论是保存还是运输，请避免反复冻融。反复冻融，冰晶会破坏抗体和重组蛋白的空间结构，导致蛋白变性形成多聚体和重组蛋白构象改变，从而降低抗体的结合能力，也加快了抗体球蛋白和重组蛋白的降解速度。抗体和重组蛋白保存得当与否，直接决定了抗体和重组蛋白的活性使用效果，如果保存得当，抗体和重组蛋白活性大部分都可以维持数年。

1. 收到抗体和重组蛋白后的操作

收到抗体和重组蛋白后（大部分抗体和重组蛋白是溶液态），请务必在 4℃，12000rpm，离心 3 分钟，再打开管盖进行分装、溶解和保存（如果抗体和重组蛋白体积小于 50µl，请延长离心时间至 5 分钟，以保证全部抗体和重组蛋白均离心下来，干粉状态的同样适用）。抗体和重组蛋白使用特制的储存管，只有在 12000rpm 离心 3 分钟，才能将附着在管壁或盖内的抗体和重组蛋白全部离心下来（即使是在 10000rpm 离心也会离心不全，导致出现抗体和重组蛋白的量不足的现象）。请详细阅读说明书，并按照推荐的保存条件正确保存和使用抗体和重组蛋白。

2. 抗体和重组蛋白的长期保存

对于大部分抗体和重组蛋白，比较合适的保存方式是：抗体分装后保存在 -20℃，重组蛋白分装后保存在 -80℃。

（1）分装可以大程度的降低反复冻融对抗体和重组蛋白活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体和重组蛋白造成的污染可能性。

（2）分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于 10 µl 每份。因为分装体积越小，抗体和重组蛋白的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。

（3）复融后的分装抗体和重组蛋白如果一次用不完，将剩余母液保存在 4℃，避免再冻起来。

（4）抗体和重组蛋白工作液应该当天配制当天用完，4℃ 保存尽量不要超过 1 天。

（5）绝对避免将抗体和重组蛋白保存在自动除霜冰箱中，将抗体和重组蛋白保存在冰箱里层，避免温度变化造成反复冻融。

3. 抗体和重组蛋白的短期保存

大部分的抗体和重组蛋白收到后 4℃ 短暂保存 1~2 周，对抗体和重组蛋白活性没有影响。如果抗体和重组蛋白很快会使用（1~2 周内），推荐在 4℃ 保存，这是为了避免反复冻融对抗体和重组蛋白活性的损害。最关键的一点是要根据说明书推荐的方式来正确的保存抗体和重组蛋白。

4. 抗体和重组蛋白的运输条件

一般的运输过程需要 1~2 周的时间，所以是在低温 4℃ 的条件下来完成的。4℃ 运输最主要的目的是为了避免反复冻融对抗体和重组蛋白活性的损害（如果使用干冰运输，那么收到时抗体和重组蛋白是冻起来的，为了分装就需要解冻，这就多了一次冻融的过程），所以运输过程中一般避免干冰运输。

5. 抗体和重组蛋白的稳定性

（1）抗体的稳定性是自然界长期进化的结果，抗体是免疫系统中最重要的分子之一，其稳定性是自然进化筛选的结果，在众多物种中，抗体分子形成了保守而稳定的结构。

（2）抗体的高Tm值，在室温下，甚至短时间温度达到 50~60℃，抗体分子都能维持正确折叠，保持其应有的活性。

（3）抗体和重组蛋白的纯度。 采用先进的抗体和重组蛋白纯化技术，确保抗体和重组蛋白产品的高纯度，保障其抗体和重组蛋白产品的稳定性。

（4）抗体和重组蛋白的浓度。高浓度的抗体和重组蛋白产品可减少容器表面吸附造成的物质损失，高浓度的抗体和重组蛋白稳定性更好。大部分抗体和重组蛋白浓度为 1mg/ml，抗体和重组蛋白纯度高，特异性好，效价更高。

6. 重组蛋白的特性

重组蛋白分为冻干粉和溶液态两种保存形式，原核细胞表达的重组蛋白为冻干粉状态，真核细胞表达的重组蛋白为溶液态保存，这样使得重组蛋白非常稳定，在 -80℃ 条件下可保存数年。冻干粉在使用前需进行溶解，其中溶解的方法非常关键，因为溶解不好会降低蛋白的效用。溶液态保存的重组蛋白在冻融稀释使用过程中也需要仔细注意，这些都是用户在实际应用中经常遇到的问题。

（1）原核细胞表达的重组蛋白。 大肠杆菌表达的冻干重组蛋白，已经从包涵体中提纯，添加了蛋白保护剂，使用过滤后的无菌水作为复溶剂即可，复溶冻干蛋白 100µg，用 86µl 的超纯水，轻轻摇晃使蛋白溶解，再用移液枪的枪头轻吹几下即可全溶解，一定不能使用涡旋仪进行快速振荡或剧烈摇晃。

（2）真核细胞表达的重组蛋白。有活性的蛋白质不仅要转录和翻译，还要进行翻译后的加工，使得蛋白质的空间折叠方式维持正常，所以重组蛋白必须在真核细胞中进行，如哺乳动物细胞能够识别和去除基因中的内含子，对翻译后的蛋白质进行加工，这样表达的蛋白质具有生物活性。我们用溶液态来保存，保持了其良好的活性和稳定性。

（3）重组蛋白的保护剂。在冻干和储存过程中常用的保护剂或稳定剂有糖类，多元醇，聚合物，表面活性剂，某些蛋白和氨基酸等。我们通常加 8%（质量比体积）的海藻糖和甘露醇作为冻干保护剂。海藻糖可明显阻止蛋白质二级结构改变以及冻干过程中蛋白质的伸展和聚集，甘露醇也是一种普遍应用的冻干保护剂和填充剂。

微生物培养的污染因素及预防方法

随着现代生物学研究的发展，微生物培养成为了重要的实验手段之一。然而，在进行微生物培养过程中，存在着许多污染因素，这些污染因素可能会对实验结果产生影响或者导致实验结果不准确。下面将介绍一些常见的微生物培养的污染因素以及相应的预防方法。

1.培养箱内的风速和风向对于保持温度的均一性以及避免污染都非常重要。一般来说，适当的风速和风向可以帮助培养箱内的温度保持均一，有利于微生物的正常生长。然而，当风速过大时，可能会导致培养基干裂，从而影响培养结果的准确性。另外，药典要求培养皿倒置培养，这是因为经过多次验证发现，当培养箱运行时的风向与培养皿盖的朝向不一致时，容易引入空气中的灰尘、杂菌等，从而污染培养物。因此，在使用培养箱的过程中，需要注意风速和风向的控制，并尽量与培养皿盖的朝向一致。

2.培养皿由平底和盖组成，一些微生物实验室常用的培养皿直径为90mm，采用顶盖封装。然而，由于不同厂家制造的培养皿的成型工艺和参数不同，平底和盖之间的间隙也存在差异。这些间隙虽然能够满足需氧型微生物对氧气的需求，但也增加了污染的可能性。经过实验证实，在同样的培养条件下，间隙大的培养皿比间隙小的培养皿更容易受到污染。此外，间隙的大小不同还会导致培养皿内培养基的水分蒸发不一致，从而影响培养结果数据的一致性。因此，在使用培养皿的过程中，需要选择质量可靠的培养皿，并注意平底和盖之间的间隙情况。
3.微生物生长需要一定的湿度条件。湿度对微生物生长的影响是通过影响微生物细胞内水分活度进而影响其新陈代谢来实现的。不同微生物的生长对湿度有一定的要求，一般来说，细菌最为敏感，酵母和霉菌次之。降低湿度会使微生物的水分活度降低，从而减慢其生长速度。因此，在微生物培养的过程中，需要保持适宜的温度和湿度，以有利于微生物的生长。培养箱内湿度的来源主要有培养基的水分散失、湿度自动调控系统以及培养箱所在的环境。因此，在使用培养箱的过程中，需要控制湿度，保持适宜的生长环境。

4.培养物溢洒是指含有生物危险物质的液体或固体物质意外与包装材料分离的过程。一旦发生生物危害物品的溢出，尤其是含病原微生物的培养物的溢出时，会导致微生物的生长和繁殖，从而引起培养箱的污染。为了预防交叉污染，当发生培养物溢洒时，需要及时清理和消毒培养箱。应该使用有效的消毒剂对培养箱的内壁以及接触溢出物品的材料进行消毒或高压灭菌。此外，如果溢洒物中含有破碎的玻璃等材料，不得直接用手取走或弃置，应该使用硬纸板和镊子等工具处理，并将处理物放置在安全的废弃物容器中。最后，对清洁工具也需要进行消毒处理，以确保卫生安全。

5.培养箱需要放置在洁净、干燥、通风良好的自然环境中。如果环境中空气洁净度不够高，容易滋生细菌、真菌和病毒等微生物，并通过平底和盖之间的间隙污染培养基，从而影响培养结果数据的准确性。因此，在使用培养箱的过程中，需要注意放置环境的卫生和通风状况，尽量避免自然环境的污染。

综上所述，微生物培养过程中存在着多种污染因素，这些因素可能会对实验结果产生影响或导致实验结果不准确。为了保证实验结果的准确性，需要在使用培养箱进行微生物培养时，注意控制风速和风向、选择合适的培养皿、控制湿度、避免培养物溢洒以及注意自然环境的卫生状况。只有这样，我们才能够获得可靠且准确的微生物培养结果。