转染试剂的比较：siRNA 和 DNA

介绍

体外 转染过程 涉及将遗传物质引入细胞，通常通过非病毒方法用于哺乳动物细胞 [1]。各种治疗性货物分子可用于细胞内递送至癌细胞系和原代细胞，包括质粒 DNA (pDNA)、蛋白质、小分子、信使 RNA (mRNA) 和RNA，例如短干扰 RNA ( siRNA ) 和微小 RNA (miRNA) ) [2]。Altogen Biosystems 通过将组合化学、分子生物学和细胞生物学方面的专业知识应用于转染技术的开发，为特定细胞系开发优化的转染技术。

自 1950 年代以来，转染一直在使用，并且仍然是细胞生物学研究中的重要元素，其技术范围从物理技术（如电穿孔）到使用磷酸钙的化学介导转染，甚至脂质体转染技术 [3]。在脂质体转染中，遗传物质包含在脂质体中通过将材料与阳离子脂质混合，脂质体将其“货物”沉积到靶细胞中。可以针对目标细胞系优化转染试剂，也可以定制转染方案。最近出现了几种先进的方法，例如基于脂质和聚合物的载体分子。这些化合物能够产生脂质体，脂质体可以与细胞膜融合，以便将结合的 RNA 或 DNA 递送至细胞。

转染：作用机制

体外 转染是将外源分子和遗传物质、DNA或 RNA 瞬时或稳定地引入培养的哺乳动物细胞中。尽管转染技术存在方法学多样性，但化学转染是当前实验室研究中使用的技术。使用的转染试剂含有阳离子脂质，有助于将 DNA 和 siRNA 递送到细胞中 [4]；虽然阳离子聚合物是最早使用的化学品之一，但阳离子脂质现在是当今使用广泛的化学品。化学转染背后的科学原理保持不变，它基于载货分子与细胞膜脂质双层之间的静电相互作用. 基本上，带负电荷的遗传物质与带正电荷的试剂结合，使遗传物质能够穿过细胞膜，从而通过内吞作用发生细胞摄取。在细胞内部，转染复合物可用于多种目的。如果 DNA 被转染，则稳定表达需要它进入细胞核，从而导致基因表达 [5]。可能影响特定化学选择的因素取决于转染的遗传物质，但 pH 值、细胞类型以及遗传物质与试剂的比例等因素对于正确的实验设置至关重要。

转染方法

将 DNA 和 RNA 引入培养的哺乳动物细胞可能需要不同的转染方法，具体取决于特定的细胞系和最终目标。此类方法包括脂质体介导的转染、非脂质体转染剂（脂质和聚合物）、基于树枝状聚合物的转染、电穿孔、显微注射、病毒介导的基因递送、RNA 干扰 (RNAi)、siRNA 转染、高通量 siRNA 筛选和基因沉默 (RNAi) [6, 7, 8]。

转染试剂

对于化学转染实验来说，保持细胞活力极为重要；如果细胞因用于转染的有毒化学品而死亡，则实验结束。转染试剂之所以众多，正是因为某些细胞类型需要更温和的条件或特殊添加剂来防止细胞毒性。就此而言，Altogen Biosystems 提供了专为特定细胞系设计的种类齐全的试剂，专门设计用于提高转染效率，同时防止细胞死亡。

转染试剂本身由专门针对特定细胞类型优化的缓冲液配方组成。在某些情况下，转染试剂可包括旨在帮助所需化合物进入细胞的分子。例如，脂质体转染试剂将包括脂质体链，其封装给定的核酸序列并允许其被细胞内吞。另一个例子是用纳米粒子制成的转染试剂，它可以结合所需的序列并帮助它们穿过细胞膜。

与所需货物结合的转染试剂和影响细胞膜的转染试剂之间应该有一个重要的区别。例如，电穿孔缓冲液是一种转染试剂，它允许细胞膜变得可渗透，从而允许外来颗粒进入细胞。然而，电穿孔缓冲液不封装核酸序列，因此电穿孔实验必须依赖转染化合物的独立稳定性。

体外 转染研究

Altogen Biosystems 提供针对不同细胞系优化的不同体外转染试剂，例如 A549 细胞（肺癌）、DU145 细胞（前列腺癌）、MCF-7 细胞（乳腺癌）和 HepG2 细胞（肝细胞癌）。以下是使用  细胞系特异性体外转染试剂进行的几项研究的数据汇编。

A549细胞转染试剂（肺癌细胞，CCL-185）

图 1.按照推荐方案转染靶向 Lamin A/C mRNA 或非沉默对照 siRNA 的 siRNA。在转染后 48 小时，通过 qRT-PCR 分析 A549 细胞的基因表达水平。18S rRNA 水平用于标准化 Lamin A/C 数据。将值归一化为未处理的样品。数据为平均值±SD (n=3)。

• 双组分制剂提高了脂质介导的转染效率，

• 为 RNA 和 DNA 的转染提供了优化的易于使用的转染方案

• 血清存在下的高转染效率

• 适用于标准反向转染和高通量应用。

• 试剂表现出至少 80% 的 siRNA 转染效率。转染效率通过实时RT-PCR确定。

图 2. Lamin A/C 在 A549 细胞中的蛋白质表达。按照 Altogen Biosystems 转染方案，将表达 Lamin A/C 或靶向 Lamin A/C 的 siRNA 的 DNA 质粒转染到 A549 细胞中。在转染后 72 小时，通过蛋白质印迹分析细胞的蛋白质表达水平（通过总蛋白质标准化，每孔加载 10 µg 总蛋白质）。未处理的细胞用作阴性对照。

DU145 细胞（前列腺癌细胞，HTB-81）转染试剂

图 3.按照推荐方案将靶向 Lamin A/C mRNA 或非沉默对照 siRNA 的 siRNA 转染到 DU-145 细胞中。在转染后 48 小时，通过 qRT-PCR 分析细胞的 Lamin A/C 基因表达水平。18S rRNA 水平用于标准化 Lamin A/C 数据。将值归一化为未处理的样品。数据为平均值±SD (n=4)。

• 专有阳离子脂质配方

• 小RNA（siRNA、shRNA、miRNA）、mRNA、pDNA的高转染效率

• 产生一致的结果，批次到批次、板到板和孔到孔

• 一种经过验证的用于建立稳定细胞系的试剂

• 优化的转染方案适用于标准和反向转染方法。

• 有效且稳健的细胞内递送

• 试剂盒包括转染增强剂试剂

• 在血清存在下工作

• 试剂表现出至少 75% 的 siRNA 转染效率。通过 qRT-PCR 确定转染效率。

图 4. Lamin A/C 在 DU145 细胞中的蛋白质表达。按照 Altogen Biosystems 转染方案，将表达 Lamin A/C 或靶向 Lamin A/C 的 siRNA 的 DNA 质粒转染到 DU145 细胞中。在转染后 72 小时，通过蛋白质印迹分析细胞的蛋白质表达水平（通过总蛋白质标准化，每孔加载 10 µg 总蛋白质）。未处理的细胞用作阴性对照。

MCF-7细胞转染试剂（乳腺癌细胞，HTB-22）

图 5 。在用靶向 GAPD 或非沉默 siRNA 的 siRNA 转染的 MCF-7 细胞中，使用实时 RT-PCR 对 GAPD mRNA 水平进行量化。转染后 48 小时，收获细胞并通过实时 RT-PCR 分析 GAPDH mRNA 表达水平。数据针对 18S rRNA 信号进行标准化。对照样品是模拟转染的或未处理的。将值归一化为未处理的样品。数据为平均值±SD (n=3)。

• 专有阳离子脂质配方

• 小RNA（siRNA、shRNA、miRNA）、mRNA、pDNA的高转染效率

• 产生一致的结果，批次到批次、板到板和孔到孔

• 在血清存在下工作

• 一种经过验证的用于建立稳定细胞系的试剂

• 试剂表现出至少 85% 的 siRNA 转染效率。通过 qRT-PCR 确定转染效率。

图 6. MCF-7 细胞中 GAPDH 的蛋白表达。按照 Altogen Biosystems 转染方案，将表达 GAPDH 或靶向 GAPDH 的 siRNA 的 DNA 质粒转染到 MCF-7 细胞中。在转染后 72 小时，通过蛋白质印迹分析细胞的蛋白质表达水平（通过总蛋白质标准化，每孔加载 10 µg 总蛋白质）。未处理的细胞用作阴性对照。

HepG2细胞转染试剂（肝癌细胞，HB-8065）

图 7.在转染了靶向 GAPD 或非沉默 siRNA 的 siRNA 的 HepG2 细胞中，使用实时 RT-PCR 对 GAPD mRNA 水平进行了定量。转染后 48 小时，收获细胞并通过实时 RT-PCR 分析 GAPDH mRNA 表达水平。数据针对 18S rRNA 信号进行标准化。对照样品是模拟转染的或未处理的。将值归一化为未处理的样品。数据为平均值±SD (n=3)。

• 小RNA（siRNA、shRNA、miRNA）、mRNA、pDNA的高转染效率

• 有效且稳健的细胞内递送

• 产生一致的结果，批次到批次、板到板和孔到孔

• 在血清存在下工作

• 一种经过验证的用于建立稳定细胞系的试剂

• 试剂表现出至少 90% 的 siRNA 转染效率。通过 qRT-PCR 确定转染效率。

图 8. HepG2 细胞中 GAPDH 的蛋白表达。按照 Altogen Biosystems 转染方案，将表达 GAPDH 或靶向 GAPDH 的 siRNA 的 DNA 质粒转染到 HepG2 细胞中。在转染后 72 小时，通过蛋白质印迹分析细胞的蛋白质表达水平（通过总蛋白质标准化，每孔加载 10 µg 总蛋白质）。未处理的细胞用作阴性对照。

结论：

转染是一项经过充分测试且至关重要的生物技术，它使研究人员能够直接在细胞中研究基因产物和基因功能。不同的转染方法允许以非常特定的方式传递遗传物质，从而使其成为临床前生物学研究中极其通用的工具。选择最佳方法涉及实施最佳转染试剂，以及选择最佳实验设计。

Altogen Biosystems 提供预优化和细胞系特异性体外转染试剂和试剂盒。在他们的网站上了解更多关于这些转染试剂和试剂盒的信息，并加快您今天的临床前生物学研究。