金纳米粒子的常见应用——使用金纳米颗粒缀合物进行免疫印迹

使用贵金属纳米颗粒缀合物进行免疫印迹

由于制备贵金属纳米颗粒（例如金和银）的抗体缀合物相对容易，并且无需事先开发程序即可通过肉眼直接检测，因此这些探针在许多测定中具有很大的用途。应用包括快速测试，例如横向流动、垂直流动、蛋白质印迹和斑点印迹测定。此外，每种贵金属纳米粒子类型的光学特性 允许生成具有不同颜色的二次探针，可用于比色多重检测，图 1。

当用贵金属蛋白缀合物（例如二级金缀合物）探测印迹蛋白的膜时，在纳米颗粒探针结合后，目标蛋白的存在会以红色指示，如图 1 所示。免疫印迹和斑点印迹应用中的银到结合的金缀合物的灵敏度可与比色检测方法相媲美。此外，二级贵金属纳米颗粒蛋白缀合物很好地适应标准蛋白质印迹方案，并且对您当前的检测方案几乎不需要改变。 

与传统检测探针相比，使用贵金属纳米颗粒蛋白缀合物进行免疫印迹具有多种优势，例如： 

• 检测无需开发

• 检测不需要昂贵的成像设备

• 允许比色多重分析

以下是使用二级金缀合物检测膜上抗原的标准斑点印迹方案。相同的方案可用于金纳米海胆、银纳米颗粒和合金纳米颗粒蛋白质缀合物探针。

标准免疫金斑点印迹实验方案

1. 将 1 微升连续稀释的蛋白质（0.1 – 100 ng）滴在添加有 50 ug/ml BSA 的 PBS 中，滴在硝酸纤维素膜或 PVDF 膜上。

2. 让蛋白质滴干燥进入膜中。

3. 在室温下使用 1% (w/v) 奶粉的 1X PBS 将膜封闭 30 分钟。

4. 与一抗在室温下孵育 2 小时。

5. 用上述制备的封闭液清洗膜 3×5 分钟。

6. 用 0.2% 奶粉按 1:10 (OD=0.3) 稀释的二级金结合物孵育 2 小时（或更长的时间以提高灵敏度）。注意：有关金缀合物的制备，请参阅技术说明#102。

7. 如上所述洗涤 3×5 分钟。

8. 干燥膜并记录数据。

9. （可选）继续进行银增强以提高灵敏度。

图 1. 使用 Cytodiagnostics 膜银增强试剂盒增强前后 Cytodiagnostics 链霉亲和素金缀合物（左上）和我们的链霉亲和素银缀合物（右上）的斑点印迹分析示例。下图展示了使用具有不同光学特性的贵金属纳米粒子缀合物的混合物同时多重检测三种不同抗原，即抗人IgG 30nm金/银(20/80)合金缀合物（绿色）、a-小鼠IgG 30nm金/银 (80/20) 合金缀合物（红色）和 a-兔 IgG 40nm 金缀合物（紫色）。

图 2. 垂直流斑点印迹免疫分析中的多重检测。左图显示 3 个抗原（红点）和对照中的 2 个呈阳性检测。右图显示使用两种不同颜色的纳米颗粒探针（红色：金纳米颗粒，蓝色：金纳米海胆）对两种不同抗原的阳性检测。 

图 3. 使用兔抗肌动蛋白一抗对纯化肌动蛋白进行蛋白质印迹检测，然后使用 10nm 抗兔 IgG 金缀合物进行二次检测，并使用 Cytodiagnostics 膜银增强试剂盒进行增强。 

金纳米粒子产品选择指南

根据您的具体应用选择金纳米颗粒产品

银纳米粒子产品选择指南

根据您的具体应用选择银纳米颗粒产品

Cytodiagnostics 是一家生物技术公司，总部位于加拿大安大略省伯灵顿和美国俄克拉荷马州塔尔萨。公司重点是为国际生命科学和材料科学市场提供和开发纳米技术衍生产品和服务，并且已经这样做了 15 年以上。Cytodiagnostics 还拥有一家联营公司CytoGroup，专门从事侧流和垂直流测定以及 ELISA。产品和开发服务均可用。我们的生命科学产品组合包含专为体外和体内研究及检测开发量身定制的产品和服务，包括以下产品线：

静脉内磁性纳米粒子癌症热疗

通过交变磁场加热的磁性纳米颗粒可单独用于治疗癌症，也可与放疗或化疗结合使用。然而，直接瘤内注射会受到肿瘤不一致和侵袭性的影响，通常会留下治疗不足的区域，从而导致癌症再生。静脉注射更忠实地负载肿瘤，但迄今为止，在发生全身毒性之前很难在肿瘤中达到必要的浓度。在这里，我们描述了磁性纳米颗粒的使用，在皮下鳞状细胞癌小鼠模型中，以耐受良好的静脉剂量，达到了 1.9 mg Fe/g 肿瘤的肿瘤浓度，肿瘤与非肿瘤的比率 > 16。通过在 980 kHz 下施加 38 kA/m 的磁场，肿瘤可以在 2 分钟内加热到 60°C，以毫米 (mm) 精度持久消融它们，使周围组织完好无损。

蛋白质如何与羧化金纳米颗粒的共价结合

金纳米颗粒缀合物已广泛应用于生物研究和生物传感应用。例如，金纳米颗粒可以用作光学或电子显微镜、侧流免疫测定和免疫印迹方案（例如斑点印迹和蛋白质印迹）中的探针。 

制备金缀合物有两种方法，即被动吸附和通过连接体的共价偶联。尽管制备过程相对简单，但蛋白质对金纳米颗粒的被动吸附并不能提供涂层的附着，因为随着时间的推移，分子可能会从表面解吸。此外，在某些情况下，蛋白质在吸附到表面后会失去其特性，这可能是由于三级结构的变化或活性位点/抗原结合位点与金表面的结合使其难以接近而引起的。

尽管存在这些缺点，蛋白质被动吸附到金纳米颗粒上仍然很受欢迎，并且是生成蛋白质金缀合物的简单方法。通过被动吸附到标准球形金纳米粒子来制备金纳米粒子蛋白缀合物，可以使用我们方便的被动吸附金缀合优化套件进行优化。

与被动吸附相比，共价偶联将感兴趣的分子固定在功能化金纳米颗粒上（例如带有NHS、羧基或胺基团）。与被动吸附方法相比，这种方法大大提高了蛋白质涂层的稳定性。共价偶联使用与待缀合分子上的特定化学基团反应的化学接头。因此，该方法比被动吸附方法更具特异性和可控性，并且可以针对特定应用优化共价缀合配体的数量。通过接头的共价偶联还具有最小化空间位阻和对缀合蛋白三级结构的影响的优点。总而言之，这对缀合蛋白的性质产生的有害影响较小。 

我们的羧基金纳米粒子、羧基金纳米海胆和羧基金纳米棒均依赖于 EDC/NHS 化学进行结合。 EDC 和 NHS“激活”颗粒表面的羧基，形成中间体，随后与特定蛋白质或其他待缀合配体上的伯胺基团反应。EDC 缀合的效率通常较低，并且对 pH 值和共价键敏感耦合协议需要一定程度的优化才能实现所需的性能或稳定性。 

以下方案提供了将生物分子与我们的羧化金纳米颗粒偶联的一般指南，以标准 IgG 与我们的 20 nm 羧基金纳米颗粒的偶联为例。对于其他生物分子或纳米粒子类型的缀合，最佳缀合条件可能会有所不同。为了获得与颗粒表面的最大结合，用于结合的蛋白质的量比全覆盖所需的理论量多大约1至10倍。 

所需材料和设备

• 20nm羧基金纳米粒子 

• 甲基金纳米粒子（阴性对照）

• 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐 (EDC)（Sigma，目录号 E1769）

• N-羟基磺基琥珀酰亚胺 (Sulfo-NHS)（Sigma，目录号 56485）

• 阳性对照蛋白：辣根过氧化物酶 (HRP) 或来自人血清的 IgG（Sigma，目录号 I4506）

• 阻断剂：牛血清白蛋白 (BSA)（Sigma，目录号 A3059）

• 激活缓冲液：2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES) 缓冲液（10 mM，pH 5.5）

• 偶联缓冲液：1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)

• 洗涤缓冲液：1X 磷酸盐缓冲盐水 + 0.05% Tween 20 (PBST)

• 紫外可见分光光度计

• 待缀合的目标蛋白

注意：待缀合的蛋白质必须是纯净的且不含污染蛋白质（例如 BSA）和其他含胺成分。任何其他含有伯胺的分子都可能与待缀合的蛋白质竞争，并可能导致缀合效率显着降低。该蛋白质还应该具有足够的可接近的伯胺基团用于缀合。赖氨酸残基是 EDC 缀合的主要靶位点。 

程序

1. 如果金纳米粒子的浓度低于OD 50，则通过离心浓缩它们。如果缓冲液中有颗粒，则通过离心在纯水中清洗它们。有关说明，请参阅“金纳米颗粒处理和储存”。

2. 在 MES 缓冲液中制备浓度分别为 30 和 36 mg/mL 的新鲜 EDC/NHS 混合溶液。请注意，EDC/NHS 在水溶液中会迅速水解，应在结合前新鲜制备。

3. 取 10 µL 20 nm 金纳米粒子（水中 OD 50）并与步骤 2 中制备的 10 µL EDC/NHS 混合溶液混合。

4. 室温孵育 30 分钟

5. 添加 1 mL PBST 并涡旋 

6. 6,500 g 离心 30 分钟

7. 除去大部分上清液

8. 添加 10 µL 抗体（1 X PBS 中 1 mg/mL）*

9. 在水浴超声仪中超声 10 秒

10. 室温下搅拌孵育 2 至 4 小时

11. 添加 1 mL PBST 并涡旋

12. 6,500 g 离心 30 分钟

13. 除去大部分上清液

14. 添加 50 µL PBS 和 1% BSA

15. 储存于 4 度即可使用

* 蛋白质的浓度可能会根据颗粒大小和要结合的蛋白质而变化。一般来说，蛋白质的量应比全表面覆盖的量多 1 至 10 倍。应估计颗粒的总表面积和对接面积，以计算最佳的蛋白质含量。下表是将 IgG 与不同尺寸的羧基金颗粒结合的一般参考。其他蛋白质的计算类似，但需要计算您感兴趣的蛋白质的对接面积。

表 I.  EDC 缀合期间不同尺寸的羧基金纳米颗粒的 IgG 的建议量。 IgG 分子的对接面积估计为 45 nm2。 “NX全覆盖量”是指孵育量与颗粒表面全覆盖所需量之间的过量比。