细胞库实践综合指南

细胞培养的有效管理对于保持其在研究和治疗应用中的完整性至关重要。细胞系的连续或长期培养会导致各种并发症，例如:

• 微生物污染:

  开放培养容易受到各种微生物感染，这些微生物会改变细胞行为和生存能力。

• 特征变化:

  关键的细胞特征，如抗原表达或抗体产生，可能会随着时间的推移而丢失。

• 遗传变异:

  基因组不稳定性可能发生在以核型不稳定而闻名的细胞系中，从而导致不可靠的实验结果。

• 寿命限制:

  某些类型的细胞在进入衰老和停止增殖之前分裂次数有限。

• 交叉污染风险:

  长期培养增加了一个细胞系污染另一个细胞系的风险，从而导致错误的数据。

• 资源密集度:

  长期培养需要更多的消耗品和劳动力，大大增加了成本。

细胞库的战略方法

细胞库系统是减轻上述风险的战略方法。推荐的系统是主小区银行系统，包括以下步骤:

1. 初始隔离:

   新获得的细胞培养物应在严格的检疫条件下隔离和处理，以防止实验室污染。

2. Token Stock Establishment:

   初始培养扩增后，应冷冻保存少量安瓿瓶（3-5瓶）作为应急备用的象征性储备。

3. 主细胞库形成:

   从代币储备安瓿瓶扩大培养物，以建立由大量安瓿瓶组成的主细胞库（10-20个或更多，根据计划使用情况而定）。

4. 严格的质量控制:

   主细胞库的一个子集经历了全面的质量控制测试，其中包括评估细胞活力，确认不存在微生物污染物，并可能进行病毒和真实性测试。

5. 工作细胞库的开发:

   然后使用主细胞库的一部分创建工作细胞库，这是积极研究和应用的主要来源。

详细的质量控制协议

质量控制是维护细胞库的关键部分。它包括:

• 生存力和计数测试:

  确保细胞存活且数量充足。

• 微生物筛选:

  定期检测细菌、真菌和支原体以防止细胞培养受损。

• 认证程序:

  通过DNA分析等方法确认细胞系的身份。

存储和使用建议

正确的储存条件如下:

• 专用存储设施:

  利用专门为储存细胞库设计的设施，如液氮罐或电冰柜，以防止交叉污染并确保长期生存能力。

一致性和质量保证:

• 一致的细胞材料:

  细胞库系统确保实验中使用的所有材料都来自一致的来源。

• 受控通道数:

  通过使用在可控传代次数范围内的细胞，实验可变性被最小化。

• 适时文化实践:

  仅在必要时培养细胞有助于保持细胞系的原始特性，并降低与保持连续培养相关的成本。

细胞破碎设备和技术综述

珠磨均质机

超过40%的实验室匀浆器专门用于破碎细胞。在实验室均质器的一般类别中，珠磨，通常称为串珠，是这一大类中的最新产品，是传统的转子-定子和超声波方法成为细胞和组织破碎的方法。

在珠磨过程中，将组织或微生物的悬浮液与大量微小的玻璃、陶瓷或钢珠混合，并通过摇动或搅拌进行剧烈搅拌。当珠子与细胞碰撞时，通过珠子的压碎作用发生细胞破裂。与超声波和高压细胞破碎方法相比，珠磨法的剪切力相对较低。通过选择正确大小的珠子和适度的摇动速度，细胞膜的回收率很高，并且通常可以分离出完整的细胞内细胞器。在较高的振荡能量下，beadbeating被认为是破碎孢子、酵母和真菌的方法，并成功地应用于难以破碎的细胞，如蓝细菌、分枝杆菌、孢子和微藻。最近，珠磨机均化已应用于土壤样品和植物及动物组织的小样品。如果采用PCR技术，这种均质化方法是少数几种可以避免样品之间交叉污染的方法之一-主要是因为该方法中使用的小瓶和珠子都是一次性物品。

所用珠子的直径很重要。细菌和孢子的最佳尺寸为0.1毫米，酵母、菌丝体、微藻和单细胞动物细胞如白细胞或胰蛋白酶组织培养细胞的最佳尺寸为0.5毫米，组织如脑、肌肉、叶子和皮肤的最佳尺寸为1.0或2.5毫米。通过使用由氧化锆-二氧化硅或氧化锆而不是玻璃制成的类似尺寸但更重的陶瓷珠，破碎速度提高了约50%。破坏真正坚韧的组织有时需要铬钢珠——其密度是玻璃珠的5倍。

虽然微型阀中的钢珠可用于“摇动式珠磨机”，但它们太重而无法用于“转子式珠磨机”。即便如此，在一些高能振动式珠磨机中，钢珠可能会使常见的聚丙烯微孔破裂。为了避免这种微孔限制，俄克拉荷马州巴特尔斯维尔的BioSpec Products公司提供了强化聚丙烯微孔（品牌为“XXTuff”）或不锈钢微孔。有报道称，由碳化硅或石榴石制成的边缘锋利的非珠状颗粒也能很好地破坏坚韧的组织。小瓶中足够的珠装量通常约为小瓶总体积的20-50%。并且，在转子型压条搅拌器的情况下，相对于腔室容积的压条装载容积约为50%。通常，珠子与细胞悬浮液的体积比越高，细胞破碎的速度越快。在珠磨机中均化后，珠子通过重力快速沉降，并通过移液移除匀浆。

可以使用珠磨技术手动破碎微生物和组织:虽然这种手持方法繁琐而缓慢，但它可以作为珠磨法的初步测试:将悬浮在1mL提取介质中的微生物细胞或组织（预先切碎成非常小的碎片）添加到预先装有1mL适当大小珠子的2 mL微孔中。盖上微孔盖，在实验室涡旋混合器上搅拌混合物十分钟。

摇动式珠磨机

标准摇动式珠磨机（又名Beadbeater）可使用2 mL聚丙烯螺旋盖微量量具处理高达500 mg（湿重）的样品。还提供可容纳7 mL或更大试管的珠磨机附件。必须始终使用螺旋盖，因为在高能摇动过程中，弹簧盖微孔会释放出内含物的气溶胶。这些珠磨机将小瓶保持在垂直位置或更有效的接近水平的位置。几乎所有的机器都沿着小瓶的轴线方向摇动珠子，小瓶前后摇动的模式可以是线性的，也可以是压缩的8字形。虽然不同品牌的珠磨机之间存在一些明显的性能差异，尤其是在破碎坚韧的细胞或组织时，全破碎通常需要大约1-3分钟，并且细胞内生化物质的产量非常高。打珠后，珠子在重力作用下在几秒钟内沉淀下来，细胞提取物很容易用移液管移出。

1979年，BioSpec Products推出实验室规模的珠磨细胞粉碎机，并在市场上占据了大约20年的时间。该公司现在生产六种型号的高能实验室级珠磨机。mini beater-Plus可容纳一个2 mL螺旋盖微量比色皿，而其他三个mini beater型号一次可处理多达16、24或48个2mL微量比色皿。mini beater-96还可以处理96个深孔微孔板中的样品。他们还提供了一个可处理高达80克（湿重）微生物细胞的制备型实验室搅拌机。他们的最新产品SoniBeast可处理12个0.6毫升微管或3个2毫升微量管，与摇动式珠子搅拌器不同的是，它使用超高涡流运动搅拌珠子，该运动由30，000 rpm（500Hz）的电机驱动。SoniBeast在几秒钟内而不是几分钟内破碎细胞，使其成为市场上最快的珠磨细胞破碎机。

转子-定子均质机（也称为胶体磨或Willems均质机）

这些均质器非常适合在1毫升到几升的液体介质中均质植物和动物组织。它们通常优于刀片式折弯机。与搅拌机相比，起泡和充气现象最少，并且易于容纳小得多的样品体积。细胞物质通过位于长静态管或探针（通常称为定子）末端内部的转子产生的吸力被吸入设备。然后，材料通过位于定子附近的槽或孔离心排出。组织被反复回收，并且由于转子以非常高的速度转动，在液体剪切力和发生在探针的机械剪刀状剪切的共同作用下，组织的尺寸减小。根据组织样本的韧性，通常在5-60秒内获得所需的结果。对于细胞内细胞器或受体位点复合物的回收，使用较短的时间和/或降低的转子速度。当使用较小尺寸的转子-定子探头时，在处理前必须用手术刀或剃刀片将组织样本预先切成横截面小于1 mm的碎片，以便将样本吸入定子的孔内。如果样本已经冷冻保存，可以使用低温粉碎器（一种在液氮温度下快速粉碎组织的设备-见下文）在不解冻的情况下将组织样本破碎成小块。一些转子-定子制造商提供的探头在定子顶端有一圈锯齿状的齿，这有助于破碎最初太大而无法进入探头的样品。该功能很有帮助，但同质化时间可能会更长。与许多其他类型的机械细胞破裂机不同，转子-定子均质机在运行过程中基本不产生热量此外，转子-定子均质机不能溶解微生物-这一特性在研究土壤、粪便等中的微生物时很有用。

大多数实验室转子-定子均质机都是顶部驱动的，带有一个转速为8，000至35，000 rpm的紧凑型高速电机。转子-定子探针（统称为发生器）的尺寸可以从用于0.5-50毫升样品体积的吸管直径到能够处理10升或更多批次的更大装置不等。转子速度和定子直径之间存在重要关系。原则上，转子直径每减半，均质机的最高转子速度应加倍。它不是rpm就其本身而言，但是转子的速度是重要的操作参数。每秒10至20米（2000至4000英尺/分钟）是组织破碎可接受的速度。不幸的是，大多数小到足以轻松装入微管的商用转子-定子均质机都达不到这一速度标准。在选择转子-定子均质机时，其他因素如转子-定子设计（有很多）、结构中使用的材料以及清洁的难易程度也是需要考虑的重要因素。

实验室尺寸的均质器仅适用于中低粘度范围的液体样品。由于使用太小的装置，均化的速度和效率受到影响，并且给定均化器的转子-定子探针尺寸有效工作的体积范围只有大约十倍。转子-定子均质机可能会出现泡沫和气溶胶问题。保持均质机的一端浸没在培养基中，并使用大小合适的容器有助于解决第一个问题。方形均化容器比圆形容器效果更好，并且有利于将浸没的探针保持在偏心位置。通过使用适当覆盖的容器（VirTis、Brinkmann和Omni），可以最大限度地减少气溶胶，但不能消除气溶胶。尽管许多实验室转子-定子均质机使用全封闭电机，但没有一台电机是防爆的。因此，使用易燃有机溶剂（如丙酮、酒精或氯仿）时，应小心谨慎，在通风良好的通风柜中进行均化。

底部驱动实验室转子-定子均质机是实验室的新成员。转子-定子组件通常放置在密封的腔室或容器内，适合搅拌机电机底座，工作容积为100-1000毫升。

分散器  

与转子-定子均质器密切相关，分散器用于制备大量植物和动物水提物。转子-定子机构的构造类似于家庭垃圾处理装置，可快速均匀化和液化千克数量的生物质。样品悬浮在一升或多升介质中，装入顶部容器中，以连续或分批模式均质化。

叶片式均质机

尽管效率不如转子-定子均质机，并且通气和起泡可能是一个问题，但叶片均质机（通常称为搅拌机）多年来一直用于从植物和动物组织中生产优质布里干酪和提取物。搅拌机不能有效地破坏微生物。在这类均质机中，一组不锈钢刀片在玻璃、塑料或不锈钢容器内以6000-50000 rpm的速度旋转。叶片可以是底部驱动的，也可以是顶部驱动的。如流式细胞仪分析所确定的，一些高速匀浆器可以将组织样品减小到一致的颗粒大小，其分布小至4微米。混合后，一些植物组织匀浆会发生酶促褐变-这是一种氧化和化学交联过程，会使随后的分离过程变得复杂。通过在无氧或除氧硫醇化合物如巯基乙醇存在下进行提取，酶促褐变被最小化。聚乙烯亚胺、金属螯合剂或某些温和洗涤剂（如Triton X-100或Tween 80）的添加也将酶促褐变降低。

使用搅拌机时，与酒精或丙酮等易燃溶剂混合时要小心。搅拌机使用有刷电机来实现高速运转，因此在运转过程中会产生火花。此外，混合时容易形成气溶胶。匀浆病变组织时，使用密封的搅拌器容器，并在通风良好的安全罩中操作。

冷冻断裂或冷冻硬化

微生物糊和动植物组织可以在液氮中冷冻，然后在同样的低温下用研钵和杵研磨。坚硬的冷冻细胞因其易碎性而破裂。此外，在如此低的温度下，内部冰晶可能会产生磨损。这一过程的最终产物可以是盐粒大小的极小组织块，也可以是几乎所有细胞都被破坏的制剂。关于后者，低温冷冻是一种机械细胞破碎方法，能够递送非常高分子量的DNA。

杵和管匀浆器（也称为组织研磨机）

用来破坏新鲜的动物组织。尽管研杵和试管均质器的变体有诸如波特、波特-埃尔维耶姆、唐斯和Ten Broeck之类的名称，但作为一个整体，它们由玻璃、惰性塑料或不锈钢制成的试管组成，其中插入了由类似材料制成的紧密配合的研杵，间隙约为0.1-0.2毫米。试管和研杵的壁可以是光滑的或经过研磨的。大多数组织必须用剪刀或单刃刀片切割或剁碎成小块（横截面约1毫米），然后悬浮在试管中3-10倍体积的培养基中。杵被手动操作到管的底部，从而当组织被迫在杵的紧密配合侧和管壁之间流动时撕裂和压碎组织。当杵缩回时，研磨动作再次发生。这种低剪切方法需要重复五到三十次才能使大多数组织均质化。当试管被手动升高和降低时，通过连接到电动机的研杵以大约500-1000 rpm的速度旋转来加速该过程。虽然杵和管均质很简单，使用的设备通常也不贵，但该过程是劳动密集型的，并且当使用易碎的玻璃均质器时，存在潜在的危险。即便如此，这种均质机仍因其极其温和的作用而继续受到欢迎。这通常是从脑或肝等动物软组织中制备少量亚细胞器的方法。微生物不能用杵式均质机破碎。

固体组织压榨机和分散机

有几种机械装置通过迫使固体组织样本穿过一系列小孔或不锈钢筛网来将软组织缩小到更小的尺寸。在大多数情况下，在均质化之前没有向样品中加入液体介质，并且根据所用的压机，排出的分散组织可以具有从汉堡肉到糊状肝酱的不同质地。虽然这不是破坏细胞的有效方法本身时，它被用作使用其他物理、化学或酶方法进行均质化的预备步骤。

家用绞肉机或绞肉机已经用于制备分散的动物组织几十年了。组织被机械地推过金属筛板上的小孔，同时旋转的刀片慢慢扫过筛板的表面，并将挤出的肉切成0.3 – 0.5毫米的碎片。如果组织稍微冷冻处理，绞肉机可以更好地切割肌肉等柔性组织。

超声波粉碎机

这些设备在液体介质中产生强烈的声波压力波，并广泛用于破坏细胞。在适当的条件下，高压波会在超声波探头表面附近形成短暂的微泡，这些微泡会剧烈生长和破裂。内爆产生的冲击波被称为空化，其能量足以撕裂细胞膜，甚至可以破坏共价键。

现代超声波处理器使用由锆钛酸铅晶体制成的压电发生器。振动通过钛金属喇叭或探针传递，该喇叭或探针被调整为使处理器单元以15-25 kHz的频率共振。超声波处理器的额定功率输出从10瓦到375瓦不等。真正重要的是探针的功率密度。正如预期的那样，需要更高的输出功率来维持大尺寸探头的良好性能。对于细胞破碎，探针密度应至少为100 W/cm2，并且振动幅度越大越好（典型范围:30-250微米）。

β-内酰胺如何对您的细胞和基因治疗造成风险

β-内酰胺是一类抗生素，包括青霉素和氨苄青霉素。它们含有β-内酰胺环和可变侧链。细菌细胞质膜相关酶和青霉素结合蛋白与 β-内酰胺共价结合。随后，抗生素抑制细菌细胞壁合成的最后一步，导致自溶。

除了用作抗生素药物外，β-内酰胺还被用作 DNA 克隆的选择工具。当创建新的质粒时，会添加 β-内酰胺抗性盒。将质粒插入细菌宿主后，向培养基中添加相应的β-内酰胺将有效杀死不含目的质粒的细菌菌落。

尽管β-内酰胺有很多好处，但它们会给患者带来危及生命的过敏反应的风险。不幸的是，很难确定引起过敏反应所需的最小量的β-内酰胺，并且用目前可用的标准分析方法很难检测微量的β-内酰胺。因此，避免使用β-内酰胺以防止最终药品受到污染至关重要。

细胞和基因疗法开发商和制造商需要认识到β-内酰胺风险，并需要制定强有力的策略来防止最终药品受到污染。药品制造商在欧盟销售时必须遵守 EMA GMP 法规，在美国销售时必须遵守 21 CFR 210/211 – 不符合 cGMP 生产的药品将被视为掺假。在其 2022 年更新指南2中，FDA 建议采取严格控制措施来防止污染，包括将加工 β-内酰胺和非 β-内酰胺药物的设施分开，以及进行程序控制以防止受 β-内酰胺污染的原材料进入非β-内酰胺加工设施。

除非得到缓解，否则在使用某些抗生素（例如作为重组蛋白生产中的选择标记）的设施中生产的原材料可能会污染细胞或基因治疗药物产品。尽管在重组蛋白的下游纯化步骤中努力去除抗生素，但残留量可能仍然存在。如果在细胞疗法制造过程中将重组蛋白用于培养方案，则最终产品中残留的β-内酰胺可能会导致过敏反应。

为了您的研究药物开发和制造的最大利益，FUJIFILM Irvine Scientific 放弃在 Shenandoah 重组蛋白中使用 β-内酰胺，现在使用卡那霉素或其他非 β-内酰胺抗生素作为选择标记。青霉素和链霉素（通常称为“pen-strep”）的使用也已被淘汰，取而代之的是庆大霉素。此外，FUJIFILM Irvine Scientific 仅对用于 cGMP 制造的原材料进行资格认证，这些原材料不是在加工或含有 β-内酰胺的设施中生产的。

当您考虑培养过程中重组蛋白的来源时，请确保不存在存在 β-内酰胺抗生素的风险。询问您的重组蛋白供应商，它们是否是在使用或加工含有 β-内酰胺材料的设施中生产的，这样您就更有信心做出了正确的选择。

关于细胞分离试剂盒

细胞健康分析试剂、试剂盒和工具的简介

细胞健康分析试剂、试剂盒和工具可用于测量细胞培养活力的一般和特异性指标。其中，活力检测可用作测量细胞健康的一般指标，或与细胞毒性检测一起用于评估处理条件的影响。增殖检测通常使用DNA合成和细胞分裂作为特定条件或处理下细胞代谢活性的测量指标。细胞毒性试剂盒可采用生物还原读数来评估代谢活性。

培养物污染是进行有效、可靠细胞培养的常见障碍之一。尽管某些污染物可通过对培养物进行仔细的显微镜检查而检测到，但诸如支原体等污染物无法通过视觉方法检测。因此，应使用能够可靠检测微生物污染物的试剂盒和试剂对培养物进行定期筛查。培养室需要使用能够在污染出现时将其降低或消除的试剂，从而增强无菌技术并形成良好的培养室规范。

细胞活力和增殖检测

可测量细胞增殖和细胞活力的检测常被用于监测用各种刺激物处理后培养物中细胞的应答和健康状况。检测方法的选择取决于所要评估的细胞数、类型以及预期的结果。细胞增殖检测可以监测一段时间内的细胞数、细胞分裂的次数、代谢活性或DNA合成。使用诸如台盼蓝或钙黄绿素-AM等活性染料进行的细胞计数分析可以提供增殖率以及存活细胞的百分比。5（6）-羧基荧光素二乙酸酯N-琥珀酰亚胺酯（CFSE）是测量细胞群所经历的细胞分裂次数的常用方法。进入细胞后，CFSE会被细胞内酯酶裂解形成荧光化合物，而琥珀酰亚胺基酯基会与细胞内蛋白上的伯胺发生共价反应。每次分裂后，每个子细胞的荧光强度都会减半，使得可以通过流式细胞仪而对细胞分裂的代数进行简单的检测。

我们用于测定细胞活力和增殖的全面工具和解决方案利用了多种方法，并包括：

• DNA合成增殖检测

• 代谢增殖检测

• 发光细胞活力检测

• 荧光染料增殖检测

• 用于3D培养的活细胞/死细胞/总细胞三重染色

• 台盼蓝染料排除法活力计数

细胞毒性检测

可测量代谢活性的检测可适用于增殖、活力和细胞毒性的分析。四唑盐（如MTT和XTT）至有色甲䐶化合物的还原反应，或刃天青的生物还原反应，仅发生在代谢活性细胞中。活跃增殖的细胞会提高其代谢活性，而诸如暴露于毒素的受损细胞则会表现出活性的下降。

凋亡分析检测

细胞死亡对于发育和体内稳态过程中的多种正常生理性功能是必需的。肿瘤细胞能够逃避也被称为凋亡的程序性细胞死亡，这种能力是大多数类型癌症的标志。多种细胞蛋白，包括细胞表面受体、接头蛋白、蛋白酶和线粒体成分，可通过细胞凋亡而在细胞存活与死亡之间调节出一种良好的平衡。通过精心选择检测不仅能够帮助分析细胞培养条件和处理条件对细胞健康的影响，还能用于分析它们对细胞健康影响的机制。我们可提供用于早期、中期和晚期凋亡检测的全面检测产品线。

细胞污染检测和消除

维持无污染的细胞培养物是细胞研究的基础条件。支原体污染是普遍的细胞培养问题之一，而支原体是一种形态特征为亚微米大小且不存在细胞壁的细菌，因此难以或无法通过显微镜检出且对多种抗生素具有抗性。尽管支原体通常不会引起细胞死亡，但它们可对培养的细胞造成多种影响，包括代谢异常、增殖减慢和染色体畸变。简而言之，支原体污染降低了相关细胞系的有效性，无法为生命科学研究提供有意义的数据。

我们用于支原体检测和消除的工具包括：支原体检测和消除

• LookOut®支原体PCR检测试剂盒，及其他用于可靠、灵敏检测细胞培养物中支原体的PCR和qPCR试剂盒

• 用于通过支原体培养进行检测的胰蛋白示磷酸盐肉汤和其他试剂

• 用于通过荧光DNA染色法进行支原体检测的DNA染料

• 用于支原体污染消除的LookOut®支原体消除喷雾和试剂

水凝胶在细胞治疗中的应用

生物相容性是细胞治疗的关键，因为它涉及植入细胞在体内 发挥作用而不引起体内有害反应的能力 。在某些情况下，身体的免疫系统可以攻击植入的细胞，导致它们被排斥，或者移植的细胞可以攻击身体现有的细胞。

水凝胶能够控制具有功能和结构完整性的细胞和分子附着，使它们能够用于创造支持移植细胞的环境。这使得这些细胞能够替代或恢复因疾病或损伤而丧失的组织功能。水凝胶还可用作治疗基因的递送载体，可用于指导或增强移植细胞的功能。

我们提供各种即用型全合成肽水凝胶，它们具有生物学相关性，其配方可满足您细胞的需求。我们的 PeptiGels 具有剪切稀化和生物相容性，这意味着它们可以通过施加剪切应力（注射过程中）进行注射，并且在去除剪切力后会快速自愈。因此，我们的 PeptiGels 可用于在注射过程中输送生物细胞和分子。

PeptiGels 可用于细胞治疗的其他重要方面是它们是非动物源性基质并且缺乏免疫原性。