cytion细胞培养解离技术概述

细胞培养物解离是细胞培养物维持的关键步骤。它涉及将细胞从其生长表面分离以进行传代培养或收获。本节概述了两种主要方法：使用无酶解离缓冲液和使用酶试剂。

1. 使用无酶细胞解离缓冲液

该方法非常温和，无需使用酶即可保持细胞完整性：

1. 准备

• 确保所有试剂在使用前加热至 37°C，以避免对细胞造成冲击。

2. 去除生长培养基：

• 从培养容器中丢弃旧的生长培养基。

3. 漂洗

• 每个 T75 烧瓶或 100 mm 培养皿用 5 ml 不含钙和镁的 PBS 冲洗细胞单层。

• 在室温下轻轻摇动容器 30 至 60 秒。

• 吸出并丢弃冲洗溶液。

• 再次重复此冲洗步骤。

4. 解离

• 将大约 5 ml 无酶细胞解离缓冲液添加到容器中。

• 在室温下轻轻摇动 1 至 2 分钟，然后在显微镜下检查解离情况。

• 如有必要，用手轻敲烧瓶或培养皿以去除细胞。

• 如果细胞贴壁，让它们在室温下再静置 2 至 5 分钟，并根据需要再次敲击，使用更多的解离缓冲液。

• 细胞分离后，添加至少 5 ml 全生长培养基以中和解离缓冲液并重悬细胞。

5. 活力检查

• 在传代培养过程中监测细胞活力，确保其保持在 90% 以上。

2. 使用其他试剂进行解离

该方法允许使用各种解离试剂：

1. 去除用过的介质

• 丢弃培养容器中的旧介质。

2. 洗涤细胞

• 用不含钙和镁的平衡盐溶液清洗细胞，或使用 EDTA。

• 将洗涤液轻轻添加到细胞对面，并摇动容器 1 至 2 分钟，然后丢弃洗涤液。

3. 解离

• 每 25 平方厘米的生长表面涂抹 2 至 3 毫升所选的解离溶液，确保覆盖细胞片层。

• 将容器在 37°C 下孵育并轻轻摇动。解离通常发生在 5 至 15 分钟内，具体取决于细胞系。

• 对于顽固的细胞，敲击容器可以加快这一过程。

• 仔细观察细胞以防止过度暴露和潜在的损坏。

4. 收获细胞

• 一旦细胞分离，将其直立，让它们收集在容器底部。

• 添加完整的培养基，然后通过移液到细胞层上分散并收集细胞。

• 计数并继续传代。

在这两种方法中，重要的是通过经验观察确定每个细胞系的最佳条件。该过程应保留细胞活力，在传代培养过程中应定期检查细胞活力是否超过 90%。这些程序为研究人员根据其细胞系的具体要求和特征进行调整奠定了基础。

Cytion 细胞培养指南

Cytion 为细胞系培养提供全面的指南，强调无菌和无菌技术的重要性。我们的方案可确保在一系列细胞类型和应用中成功进行细胞培养。

1. 实验室设计

设计组织培养实验室需要周密的规划，以确保在安全高效的环境中生产高质量的材料。最佳设施包括用于检疫和处理未受污染材料的不同区域，每个区域都有专用的培养箱。当空间不允许按区域分开时，建议在时间上分开处理不同的材料。严格的清洁方案和至少遵守 2 类密封水平对于最大限度地降低污染风险和维持受控的实验室环境至关重要。

2. 建立无菌工作空间

• 引擎盖实践：通过正确定位引擎盖窗扇并避免杂乱来保持层流气流。

• 灭菌：移液器吸头、玻璃移液器等高压灭菌工具，并使用70%乙醇进行表面消毒。

3. 介质和试剂制备

• 培养基选择：查阅我们详细的培养基图表，将您的细胞系与适当的 DMEM 或 RPMI 培养基相匹配，并辅以胎牛血清 (FBS) 和谷氨酰胺等添加剂。

• 补充剂的无菌性：所有培养基和补充剂必须无菌，必要时采用过滤灭菌。

• 个人防护装备：在细胞培养实验室中，最大限度地减少伤害依赖于严格遵守个人防护装备，例如符合 EN374-3 标准的手套。

• 消毒：最大限度地减少伤害还取决于正确使用次氯酸钠或乙醇等消毒剂。为了实验室卫生的全面安全性和有效性，下表详细介绍了其他消毒剂及其具体使用案例：

 4. 培养环境设置

• 用于贴壁细胞系的烧瓶：经过组织培养处理的烧瓶通常足以容纳大多数细胞系。对于需要额外支持的某些细胞类型，可以对烧瓶进行预处理或用明胶或纤连蛋白等底物包被。这些涂层可以显着改善细胞附着和增殖。详细的制备和包衣方案可在相应的产品信息表中找到。

• 用于悬浮细胞系的烧瓶：使用专为非贴壁细胞设计的烧瓶，可使其自由移动和充分的气体交换。这些烧瓶不需要促进细胞附着的表面处理。

5. 监测细胞健康状况

维持细胞培养的健康是细胞培养工作的一个重要方面。持续监测对于确保实验结果的完整性和可重复性至关重要。以下是监测细胞健康状况的详细做法：

5.1.每日检查

• 显微镜评估：每天使用显微镜检查细胞，评估细胞健康的关键指标，包括一致的细胞附着、特征形态和预期的生长模式。寻找细胞大小和形状的均匀性、是否存在不同的细胞核以及是否缺乏可能表明细胞死亡的颗粒度。

• 生长率监测：跟踪增殖率，确保其与细胞系的预期倍增时间一致。生长速率的突然变化可能表明细胞健康或培养条件存在潜在问题。

• 培养基评估：检查培养基的颜色，它可以指示 pH 值的变化。泛黄的培养基表明酸度增加，通常是细胞代谢或细菌污染的副产品，而紫色或粉红色调则表明更碱性的环境。

5.2.废弃培养物的标准

• 污染指标：警惕污染迹象，例如培养基浑浊、意外的 pH 变化或微生物菌落的存在。污染物可以是细菌、真菌或病毒，每种类型都有不同的视觉线索，例如细菌膜或真菌菌丝。

• 形态异常：如果细胞表现出与正常生长或分化无关的持续形态异常变化，则可能需要丢弃培养物。这包括广泛的细胞变圆、脱离或细胞碎片的存在。

• 不可逆应激迹象：寻找不可逆应激或毒性的迹象，例如空泡形成、膜起泡或凋亡小体。这些通常是细胞死亡的前兆，并可能影响实验结果。

• 生长条件退化：如果培养物已达到汇合或过度生长，导致营养耗尽和废物积累，则应将培养物进行传代培养或丢弃，以避免对细胞健康产生负面影响。

6. 传代策略

传代培养或分裂细胞是细胞培养的常规部分，涉及将细胞培养物的一部分转移到新鲜的生长培养基中以繁殖培养物。仔细的规划和执行对于此过程的成功至关重要。以下是一些有效传代的增强策略：

计划分割

• 最佳分流比：根据细胞系特征、生长速率和培养物的预期用途确定理想分流比。对于快速生长的细胞，这可能涉及 1:2 的分割；对于生长较慢的细胞系，可能需要 1:10 的分割。

• 供应商规格：请参阅供应商的产品表，了解针对每个细胞系的具体建议，其中通常包括详细的传代培养方案和细胞所需的条件。

• 培养的连续性：维护主细胞库并使用一致的传代培养程序，以确保细胞系的寿命和遗传稳定性。

7. 介质维护

及时补充营养：应在细胞耗尽必需营养之前更换培养基，这对于细胞的生长和代谢功能至关重要。

pH 值和毒素控制：定期改变可防止代谢副产物的积累并维持对细胞健康至关重要的生理 pH 值。

8. 通道数控制

传代限制：保留细胞传代的详细日志。频繁传代会导致遗传漂变，从而改变细胞表型和行为。通过限制传代次数，可以保持细胞系的遗传稳定性和完整性。

传代数记录：每次细胞传代培养时，记录传代数。该信息对于跟踪细胞系历史和识别细胞行为中潜在的传代相关变化至关重要。

9. 确保细胞系完整性

• 验证记录：定期验证细胞系身份（例如，通过短串联重复（STR）分析）并在记录中对此进行注释，以确保在整个实验中使用正确的细胞系。

• 突变监测：如果可能，监测可能表明遗传漂变或细胞系污染的关键遗传或表型变化，并保存这些记录以供参考。