胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，存在于大多数哺乳动物的消化系统中，传统的细胞培养一直使用动物胰腺来源的胰蛋白酶，但是动物源胰蛋白酶存在动物源病毒（疯牛病病毒、朊病毒和猪口蹄疫病毒等）的潜在危险。自2018年非洲猪瘟疫情在中国爆发以来，外源病毒污染的风险进一步被重视，重组胰蛋白酶作为一种安全有效的替代产品，在细胞培养及生物制药中越来越受到青睐，广泛应用于细胞消化传代、病毒疫苗生产、干细胞培养、细胞治疗和原代细胞培养过程的分离和收获及重组胰岛素生产等众多领域。

Kerry Sheffield™ rTrypsin ACF重组胰蛋白酶是利用宿主天然氨基酸序列，通过真菌发酵生产，生产过程中不添加任何动物源成分，无外源病毒污染风险，安全性高，纯度高，活性强，具有与猪胰蛋白酶相似的氨基酸切割特异性。与天然胰蛋白酶一样，重组胰蛋白酶在赖氨酸和精氨酸的羧基侧切割肽键，是天然胰蛋白酶的可行替代品。Sheffield™ rTrypsin重组胰蛋白酶也被推荐用于HEK、Vero、MRC-5等贴壁细胞系。

监管相关文件及政策

国家药监局于2019年9月发布了《疫苗上市后生产工艺变更研究技术指导原则》（征求意见稿），如果疫苗生产要进行符合药典标准的原辅料变更，只需备案，即通过变更流程的简化，鼓励企业进行无动物源性原辅料的变更。

中国药典2020版三部“生物制品病毒安全性控制”章节中明确指出：“原材料及辅料应符合‘生物制品生产用原材料及辅料质量控制’的相应要求，应尽可能选择无病毒安全性风险或低风险的原材料和辅料用于生物制品生产，如选择采用重组技术生产的生物材料替代动物源性生物材料”，并增加了重组胰蛋白酶的质量标准（中国药典2020年版3603）。相关实验数据

图1 .无动物成分的rTrypsins具有与天然Trypsin相同的细胞分离效果。

图3 . Sheffield™rTrypsin和其他市售重组胰蛋白酶均未发现明显毒性。

图4 . 所有rTrypsins消化传代后的细胞倍增水平显示这些rTrypsins对细胞没有明显毒性。

实验结果显示，所有的胰蛋白酶在都能有效地分离单层细胞，表明rTrypsin可以代替天然胰蛋白酶进行细胞分离(图1 )。然而，这些被评估的胰蛋白酶都不能完全分离紧密的细胞团块。在消化单细胞层所需的时间方面，与其它商品化rTrypsin相比，Kerry Sheffield™ rTrypsin酶解速度更快(图2A & B )。细胞毒性研究表明，所有市售rTrypsins的细胞活率和细胞倍增时间均相近，表明重组胰蛋白酶对细胞无明显毒性(图3、4 )。

Kerry Sheffield™rTrypsin ACF重组胰蛋白酶的优点：

• ​无动物源成分( ACF ) ；
• 更快的细胞解离速度；
• 细胞倍增时间更短且细胞活率更高；
• 是传统动物源胰酶更经济高效的替代品；
• 应用广泛，适用多种细胞类型

Kerry Sheffield™rTrypsin ACF产品列表

免费试用申请

为了满足广大客户的需求，Sheffield™rTrypsin ACF免费试用活动正式开启，即日起至2023年1月31日，关注“上海金畔生物科技有限公司微信公众号（微信号jinpanbio）”，发送关键词“重组胰酶”，填写试用调查问卷即可获得免费试用机会，数量有限，先到先得。

美国Kerry集团旗下Sheffield Bio-Science服务于全球超过70年，作为全球生物制药疫苗行业规模大专业性强的细胞营养原料供应商，已成为全球单个药物年销售额超过10亿美金的10个“生物炸弹药”中7个生物药的培养基原料供应商，是全球少有的同时生产酵母粉和蛋白胨并针对不同细胞株/菌种开发提供非动物源性复合添加物系统的生产商，引领全球制药、疫苗、无血清培养基、传统发酵和诊断培养基工业的发展。

上海金畔生物科技有限公司为Kerry集团细胞培养系列产品中国一级代理，为客户提供完善的技术支持与售后服务。欢迎拨打上海金畔生物科技有限公司客服电话021-50837765或者登陆网站www.jinpanbio.cn了解更多信息。

细胞冻存过程中,为防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤, 需要冷冻保护剂。二甲基亚砜（DMSO）能够快速穿透细胞膜进入细胞中,降低冰点、延缓冻存过程, 同时提高细胞内离子浓度, 减少细胞内冰晶的形成, 从而减少细胞损伤，是目前广泛使用的的细胞冷冻保护剂。

AppliChem的专业细胞培养级二甲基亚砜（货号A3672），原产地德国，以其高纯度，超低金属离子含量等质控数据，严格符合细胞培养级标准。与血清或细胞培养基配合使用，为细胞提供全方位的保护。质优价廉，一直受到广大客户的青睐，年销售数千瓶 。

DMSO/二甲基亚砜除作为细胞冻存剂外，还可作为无机溶剂，广泛应用于生化试验、高效液相色谱HPLC、气相色谱GC、辅料等领域。配合这些应用，AppliChem还可以提供：

随着国家药品监督管理部门对药品生产监管力度越来越大，生物制药和疫苗生产企业对产品安全性管理要求越来越高，在疫苗生产过程中采用无动物源成份的原辅料是日益增长的要求趋势，但目前，绝大部分疫苗生产还离不开细胞培养过程中血清成份的添加，但使用血清，必须面对血清带来的系列问题和缺点：

1.     批间差较大：每批血清可能适合某些细胞系，换血清批号要做广泛实验，大量储存提高成本，且很难实现大规模生产过程的标准化，也在一定程度上影响疫苗的批次稳定性；

2.     污染风险：血清常受病毒污染，虽对多数细胞培养无害，但增加了不能控制的因素，一旦出问题，需要耗费相当大的时间、物资和人力成本去解决；

3.     不确定性：血清中含有广泛的未知微量成分，对其存在的作用还远未搞清楚，也增加了纯化和疫苗质量控制的难度；

4.     高成本：高质量血清供应不足，全球血清趋紧，且价格仍不断上升，成本往往是细胞培养基成本的数倍，给疫苗生产企业带来相当大的成本压力；

因此，如何降低血清在疫苗生产中的用量，从而减少使用血清带来的风险和高成本，是疫苗生产企业广泛关注且努力寻找解决方案的重要问题。

与传统的高血清含量细胞培养相比，采用低血清细胞培养方式，不仅能够降低疫苗安全性风险，还能提高企业生产效率，使用低血清培养基进行疫苗生产，细胞经驯化适应后，与传统培养方式相比，细胞数量有显著提高，细胞长满单层时间大大缩短，分种比例、病毒滴度也有所提高，同时减少劳动强度，从而大大提高企业的生产效率，最重要的是，降低了疫苗生产企业的综合成本。

上海金畔生物科技有限公司（以下简称上海金畔生物科技有限公司）为疫苗客户引进全球知名培养基营养添加物供应商——KERRY，其高品质的植物源蛋白水解物、复合非动物源性添加物系统、超滤酵母粉、重组低内毒素白蛋白服务于全球疫苗生产企业、培养基生产企业近70年，为广大疫苗客户很大程度上解决了血清带来的困扰。目前在国内，KERRY系列产品已经广泛应用于疫苗生产的BHK、VERO、SF-9、MDCK、MRC5等细胞株中，上市疫苗品种有：口蹄疫疫苗、戊肝疫苗、流感疫苗等，血清使用量已经从从10%降低到3%，少数客户已经实现了完全无血清培养。

使用KERRY Sheff-VAX系统用于VERO细胞降血清驯化案例

图1. Vero细胞生长形态对比。（A）对照组：10%胎牛血清；（B）：实验组：0%胎牛血清+2g/L Sheff-VAX ACF。根据观察，A对照组中的Vero细胞和B实验组的细胞没有不同。所有图片都是用100X莱卡显微镜拍摄。

图2. 以Vero细胞在含有10%的胎牛血清的培养基中生长曲线为对照组，对比细胞在逐渐减少血清的情况下加入Sheff-Vax添加物进行细胞穿戴。DMEM作为基础培养基。（i）10%胎牛血清；（ii）7.5%胎牛血清；（iii）5%胎牛血清；（iv）2.5%胎牛血清；（v）1.5%胎牛血清；（vi）1%胎牛血清；（vii）0.5%胎牛血清；（viii）0.25%胎牛血清；（ix）0.1%胎牛血清；（x）0 %胎牛血清。用逐渐减少血清的方法，可以实现Vero细胞的无血清培养。在同样的培养基时间内，有添加物培养基中的细胞可达对照组细胞密度峰值的一半。但通过延长培养时间，可获得更高的细胞密度峰值。

推荐疫苗生产细胞培养添加物系列产品介绍：

1. 全球独家非动物复合添加物Sheff-VAX系列

PF为无蛋白，plus为含微量元素

2. 非动物源Hypep系列

3. 其他相关产品

由于低血清培养基在成分配比上与基础培养基有所不同，其培养液的pH、渗透压及碳酸氢钠添加量等有所改变，以及细胞生长速度、分种比例、收毒时间及次数等都与用户以往的经验和习惯不同，在使用低血清培养基时，容易给用户造成一定的困难。因此，要使用好低血清培养基，用户必须打破以往形成的使用习惯，以一种全新的姿态来认识低血清培养基。我们可以提供以上产品的试用装，用于您工艺优化小试，如果您对以上产品感兴趣，欢迎联系KERRY细胞营养产品中国独家一级代理——上海金畔生物科技有限公司。

除以上产品以外，上海金畔生物科技有限公司还是其他全球十大生物炸弹药原辅料与服务商的中国一级代理或一级代理，目前我们提供的原辅料已经被国内近百家生物制药企业，包括国内知名的人用、兽用疫苗企业广泛使用。除降血清方案的细胞营养添加物以外，还涉及上游细胞培养原料，宿主残留检测产品与验证服务，过程污染物检测产品、高纯低内毒素海藻糖、蔗糖等顶级糖类辅料等一站式系列产品和服务。如您对以上任何产品感兴趣，欢迎致电021-50837765联系我们，在北京，上海，成都，重庆，武汉，广州，深圳等各地都有我们公司当地市场销售人员为您服务。

一说起支原体，估计细胞培养的人员就开始手心冒汗了。细胞培养中的急性污染很容易察觉，而支原体则像慢性毒药一般，杀细胞于无形中。除了非常有经验的老手，很多实验人员都察觉不到支原体的污染，据统计，超过25%的细胞系中感染了支原体，而研究者大多并不知晓。早期，血清可能是最主要的污染源；之后，通过实验室的仪器、培养基或其他试剂慢慢蔓延开来，细胞无不中招。怎样才能根除讨厌的支原体污染呢？让我们先来认识这个小东西。

狡猾的支原体

支原体是唯一一种没有细胞壁的原核生物，大多呈不规则球状或丝状。由于它的直径小，而且形状灵活，所以能逃过实验室常用的滤膜。

检测、检测、再检测

对培养物进行常规的支原体检测非常重要。尽管各个实验室的检测频率不同，从几个星期到几个月不等，不过这主要取决于你们实验室有多少人接触细胞，以及你们引进新细胞的频率。比如美国国立细胞培养中心，它经常从其他实验室获得细胞培养物，就会对每个样品进行检测，并将它们隔离，直至最后证明没有支原体污染。一般来说，每两三个月进行一次定期检测是必要的。如果有新细胞进入实验室，或准备将细胞进行液氮保存，都应该进行检测。当然，如果细胞不大对劲，应立马检测。

支原体检测：

检测频率是一方面，选择合适的检测方法也很重要。到底是PCR、生化分析，ELISA还是免疫荧光呢？PCR应该是检测支原体的理想方法，他综合了几个优势，灵敏、特异、快速、廉价等。细胞培养上清可以直接用来检测，非常方便。Applichem公司提供的高灵敏度PCR Mycoplasma Test Kit（A3744）,该试剂盒引物源于支原体基因的保守序列，而且即用型的PCRmix使您的使用更加方便，同时更是提供了阳性对照。当然为了避免假阳性和假阴性，试验中必须设立多种对照：除了阳性对照外，还有阴性对照和内对照。

用Hoechst33258染料检测支原体是很多教科书上推荐的方法。由于支原体含有DNA，能与Hoechest33258染料结合，在500倍数放大情况下，表现为细胞颗粒或纤毛染色。但操作过程较为繁琐，且需要一定的经验辨别支原体，新手可能大不容易掌握。

支原体污染和清除：

如果很不幸，你的细胞已经感染了支原体，怎么办？大部分人的想法可能都是把感染的细胞扔掉，重新开始。一旦感染了支原体，细胞复原的机会很小。所以在液氮中多储存一些备份还是比较明智的选择。

如果你的细胞非常稀有且珍贵，那只能去奋力抢救了。拿什么拯救你，我的细胞？由于支原体没有细胞壁，且代谢慢，故大部分传统的抗生素都不奏效。但是上海金畔公司提供了一些Applichem的支原体清除试剂。Myco-3（A5240），Myco-1（A5222）Myco-2(A5233)。这三类支原体清除试剂是有多种支原体敏感的抗生素研制而成，无细胞毒性。100倍浓缩液直接加入培养基，使用方便。具体的使用方法如下：

Myco-3加入培养基中，每2-3天换液一次，连续处理14天，可有效清除绝大多数支原体污染。

顽固支原体需Myco-1和Myco-2联合使用：Myco-1处理4天后换Myco-2处理3天，如此重复2-3次。

支原体预防：

虽然说支原体可以铲除，但这种劳心劳力的事情估计没有人愿意做，那么平时的预防更重要。上海金畔公司还提供了几样好东西，能预防支原体的污染。具体介绍如下Incubator-Clean（A5230）

用于CO2培养箱的消毒，喷一喷，彻底预防支原体、细菌和病毒等的污染。

Incuwarter-Clean（A5219）

用于CO2培养箱内保持空气湿度的水源消毒，100*即用型浓缩液。

Aquabator-Clean（A5225）

用于水浴的消毒，有效防止各类污染。

需要特别提及的是，液氮罐中也可能有支原体。支原体能耐受液氮的低温，虽然不会增殖，但会污染你的细胞。因此，细胞冻存管还是不要放在液氮内，以免液氮渗进入细胞，而是储藏在液氮的气相中。

不过，预防支原体污染的最佳方法还是良好的细胞培养技巧和正确的态度。虽然这些都是老生常谈，但一旦熟悉了细胞培养，就很容易麻痹大意，时常敲敲警钟还是相当必要的。下面我将上海金畔公司提供的有关支原体预防，检测和清除的产品做一个总结：

支原体预防：

支原体检测：

支原体清除：

除了支原体预防，检测和清除方面的试剂外，上海金畔公司还提供了Applichem细胞培养相关方面的其他试剂，包括各种细胞培养基，氨基酸，抗生素以及糖和盐类。同时也包含了常用的其他生化试剂，如有需要可随时拨打我们的电话：021-50837765.