细胞复苏时血清更换注意事项及步骤

血清更换注意事项及步骤

一、推荐在复苏时步骤：

1.首先准备一只15ml离心管，加入3倍以上体积培养基（含10%澳范血清，1%青链霉素的适配培养基，具体培养基类型查询ATCC）。

2.将需要复苏的冻存管放于37℃水浴锅中（液面没过冻存液），并持续轻柔晃动冻存管，直至冰晶消失。

2.迅速转移细胞至无菌操作台，酒精棉球擦拭干净冻存管表面后开盖。

3.轻柔地将细胞转移至已经准备好的无菌离心管，800-1000g离心5min（不同离心机离心力不同，请选择合适离心力），弃去上清，用上述培养基重悬细胞，放入37℃，5%二氧化碳培养箱培养。并隔天更换培养基。

二、对于对数生长期的细胞，推荐按梯度更换血清：

         将上述培养基与之前所使用培养基按1：1混匀后，采用换液法更换培养基。持续培养1代后更换为只含10%澳范血清的培养基。（其余所需物质照常添加）

三、不推荐直接更换血清：

        可能导致细胞营养不良，形态变皱缩/纤细，代谢和活性相关表型改变。

血清储存及化冻

储存：在 -15°C到-20°C低温冰箱血清的保存期限为5年。

解冻：第一步：从-40°C–80°C超低温冰箱取出后需在 -20°C冰箱平衡48小时。

           第二步：立放与水平摇床并开启摇床。若解冻血清的时候无法使用摇床则在室温下融化，前半小时内每隔5分钟-10分钟轻微晃动血清使其瓶底及瓶身周边的纤粘蛋白融化。

4度冰箱解冻血清容易造成析出并丢失贴壁因子、会影响细胞的培养。

解析：血清中含有冷不溶蛋白较多如血清中纤粘蛋白（fibronection）属于冷不溶蛋白，在4度解冻时，不会溶解，是以沉淀状态在血清中。

           冰箱存在自动化霜功能，冰箱在化霜过程中箱体处于加热状态、贴近箱体底部及周边储存的试剂容易被溶解反复冻融影响质量。实验室使用化霜冰箱的时候存放试剂时需避免直接存放在锡箔纸上面。

常见细胞污染分类和污染的处理

常见细胞污染

细胞污染——培养物出现浑浊、混浊。培养液pH值升高，液黄。细胞异常的形态，如胞质内细菌吞噬体。细胞的生长速率减缓，对数生长期变得不规律。异常的细胞死亡或细胞溶解情况。

真菌污染——培养液可能出现异味。培养皿内有异常的颜色、纹理或斑点。细胞显示出不正常的细胞形态，如真菌吞噬体或真菌丝状体。细胞的生长速率可能受到抑制，细胞数量不断减少。

支原体污染——支原体污染通常不会导致明显的细胞培养液变化。因此，支原体污染通常需要PCR或DNA杂交来检测。可能出现感染迹象，如出现包涵体或囊泡。细胞的生长速率减缓。

常见污染处理

因污染会改变细胞表型，在细胞种子充足及排除污染因素的情况下，首先丢弃污染细胞，重新复苏。

在未检测的情况下沿用当前细胞试剂及耗材可能导致污染扩散，应及时灭菌或丢弃。

如果怀疑细胞培养受到污染，应立即采取行动来确认并解决问题。常见的处理方法包括：

1.隔离：将受污染的培养物隔离，并最后处理污染细胞，以防止污染蔓延到其他培养物中。

2.污染源排除：查找和消除污染的来源，可使用无抗LB摇菌培养或污染检测试剂。

3.更换培养液：将受污染的培养液更换为新的培养液，细菌污染添加敏感抗生素如氨苄青霉素，真菌添加两性霉素B，支原体添加氧氟沙星以控制污染。

4.细胞重新传代：如有必要，将细胞重新传代到新的培养皿中，离心速度低于平时，200-300g。

5.污染检测：进行污染检测，以确认污染的类型和程度，从而采取适当的措施。

操作手册

● 原代细胞提取

● 血清更换注意事项及步骤

● 血清储存及化冻

● 持续更新中

原代细胞提取-1

固体组织样品（肝，肺，肿瘤等）

1.分离组织后立即移入超净台操作（＜20min)，或放入组织保存液中四度保存（不超过48h)。

注意：以下步骤均需无菌操作，且保持低温！

2.取一无菌小皿，加入3ml预冷的PBS，放入组织清洗。重复此步骤一次。

3.用无菌剪和无菌镊（高温高压灭菌）去除脂肪或坏死区域等非目标组织。

4.转移组织块至一无菌15ml/50ml离心管中，加入组织体积10倍的advanced DMEM/F12培养基（缓冲液可自行调整，与后续培养体系一致）。离心管置于冰上，用无菌剪将组织剪成肉泥状。（此步骤注意低温）

5.四度600g离心5分钟，去上清，加入消化液（浸没组织），37℃摇床（800rpm)消化15min，视解离状态调整消化时间，一般不超过45min。（消化液需视组织类型自行调整。一般组成为胶原酶1和4，浓度为400-1000U/ml，以及核酸酶5-20U/ml，可选择添加10uM ROCK抑制剂以提高组织活率。）

原代细胞提取-2

6.消化结束立即冰上，加入体积6%的血清终止消化，四度离心弃上清，用巴氏管吸取1-2ml全培养基重悬后细胞滤网过滤，根据后续目的和细胞类型选择滤网大小（类器官需要细胞团一般选择较大的100um，建库的单细胞悬液一般选择70um或更小）。

7.视上一步沉淀颜色选择是否裂红，裂红至沉淀无明显红色即可。裂红液现配，至少10ml，常温避光裂红10min。

8.用巴氏管充分混匀细胞悬液，吸取10ul细胞悬液与2x台盼蓝混匀后计数板计数。一般细胞活性＞85%为达标。如不达标，则低速(200-300g)四度离心后弃上清，重悬，再次计数和测量活性，直至达标。）

9.计算所需细胞数量并进行下一步操作，直接种板培养，点胶，或上机等。

液体样品（血液，胸水，腹水等）

1.直接600g四度离心5min后弃上清，用medium重悬清洗两次。

2.过滤可选，直接进入裂红判断步骤

3.后续步骤同上。

常见培养基类型及适配细胞

常见培养基类型及适配细胞

DMEM

（Dulbecco's Modified Eagle Medium）

DMEM是由美国科学家Eagle于1959年改良的，多用于上皮细胞，神经元、胶质细胞、平滑肌细胞。

        成分：DMEM包括基础培养基，如高糖量的DMEM和低糖量的DMEM。DMEM包含的主要成分包括高浓度的葡萄糖、氨基酸、维生素、盐类、L-谷氨酰胺和胰酶抑制剂。适用范围广。

MEM（Minimum Essential Medium）

        MEM最早由Eagle于1959年开发。可用于成纤维细胞和原代大鼠星形胶质细胞等。

        成分：MEM为低基本培养基。MEM可以具有不同的变种，如Eagle's MEM和Earle's MEM，它们在成分和用途上略有不同。

RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute Medium 1640）

 RPMI-1640最早是由Moore等人1966年开发的，多用于淋巴细胞和肿瘤细胞的培养。

        成分：RPMI-1640是一种富含氨基酸、维生素和微量元素的培养基。

F12（Ham's F-12 Nutrient Mixture）

  F12培养基最早是由Ham于1965年开发的。多用于MDCK、神经胶质细胞、成纤维细胞、人内皮细胞。

        成分：F12包括氨基酸、葡萄糖、核酸、维生素和盐类。另有是 DMEM 和 F12 的 1:1 混合物的DMEM/F-12 培养基。

什么是细胞外囊泡？

细胞外囊泡 (EV) 是细胞分泌的小型膜结合颗粒，被认为充当细胞信使，将货物从一个细胞运送到另一个细胞。 EV 有多种亚型，其功能、货物和尺寸各不相同，直径范围约为 30-1000 nm。最小的 EV 类型是外泌体，其大小约为 30-150 nm。 EV 起源于称为多泡体 (MVB) 的细胞区室，其本身源自内体的内陷。当 MVB 与质膜融合并释放其货物时，囊泡就会被释放。

在生物医学研究中，电动汽车及其货物被用作癌症和其他疾病的诊断生物标志物。可以使用超速离心、PEG 沉淀和免疫捕获珠等技术从血液或其他生物液体中分离 EV。

EV 膜含有源自原始细胞质膜的跨膜蛋白，其中通常包括四跨膜蛋白家族的蛋白（例如 CD9、CD63 和 CD81）。 EV 内部含有蛋白质和 RNA 等细胞质成分。 EV 成分可以使用 RNAseq、蛋白质印迹和流式细胞术等方法进行分析。为了通过流式细胞术进行表征，研究人员可以使用对 EV 成分（如膜和核酸）进行染色的染料，以及与四跨膜蛋白或其他感兴趣的蛋白质结合的抗体。

人类软骨细胞培养基概述

概述

干细胞软骨细胞培养基是从人间充质基质细胞生成软骨细胞的优化分化培养基。适用于扩张型干细胞分化能力的分析或质量控制,或 体外的 研究了干细胞间质干细胞分化的过程,包括基因表达或蛋白质特征分析。

在资源选项卡上可以找到有关MBA文化的详细方案。

详细产品信息

软骨细胞在骨的发育和愈合以及其他结构组织中起着重要作用。因此,软骨细胞是组织工程学研究的焦点,研究的疾病包括:骨软骨瘤、不愈合性骨折和骨关节炎。阐明软骨细胞的发育和调节机制(软骨发生)仍然是这些研究领域的一个关键重点,因此,需要利用优化的培养基来有效地、重复地生成软骨细胞。

在茎软骨质培养基中培养21天后,染有毛细胞(红色)和核(蓝色)的软骨细胞。

3100 型细胞内静电计

详细介绍

产品咨询

细胞内放大器：3100 型细胞内静电计是一款简单易用的低成本全功能细胞内放大器。您可以通过教学预算购买仪器来实现研究质量的录音。

常见应用包括但不限于：

• 细胞内记录

• 低噪声细胞外记录

• 电流钳

• 染料注射

放大器电流补偿电路包括双瞬态控制，可在膜记录期间对瞬态抑制进行极其精确的调整。其直流平衡控制无需外部电桥或差分输入示波器。直流偏置控制可消除高达 ±1V 的偏置。

内部方波发生器提供 100Hz 电流脉冲来确定电极电阻。容量补偿可调整高达35pF的电极电容。通过使用头部探头上的驱动屏蔽连接器可以减少额外的杂散电容。

3100 型使用先进的电容“Ringer”来清洁电极头端并增强神经元的膜穿透性。发送到电极的脉冲振荡的振铃幅度和频率可以调节。研究人员可以使用低通滤波与线路频率陷波滤波器相结合来减少无关频率和外部线路噪声。

电流注入系统允许内部产生和外部产生的电流。该电流可设置为连续或瞬时注入。电流总和可由外部 TTL 逻辑信号源选通。

放大器的小尺寸及其远程电源提供了将放大器放置在靠近实验装置的位置的优势。例如，放大器可以放置在法拉第笼内，以最小化电源线干扰。

• 噪声（10 Hz – 50 kHz）：18 µV，均方根短路； < 350 µV，20 MΩ 源

• 输入阻抗：10 13 Ω；电容可调至零

• 偏置电流：可调至零

• 电压增益：x1 和 x10

• 容量补偿：-4 pF–35 pF

• 直流偏移：±1V

• 最大内部电流：1 µA

• 外部电流：100nA/V；最大 10V

• 电极测试：100 Hz，10 nA； （即10 mV/MΩ电极电阻）

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上海金畔生物科技有限公司

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条件细胞培养基简介

什么是条件媒体？

培养的细胞通常需要添加特定的生长因子以实现增殖、分化或存活。然而，一些重组蛋白的使用成本昂贵。这要么是因为它们难以制造（因此成本高昂），要么是因为它们需要大量。

生产纯化重组蛋白的大部分成本是纯化步骤。然而，如果重组蛋白由生产细胞分泌到周围介质中，则可以避免纯化。为了使细胞培养变得经济实惠，许多研究人员选择通过将培养基与生产细胞一起孵育，将这些重组蛋白直接添加到细胞培养基中。在用生长因子调节培养基后，可以立即将其储存或转移到需要它的感兴趣的细胞上。这种含有细胞分泌的成分且另一组细胞需要的成分的培养基称为条件培养基。

Wnt-3a 和 R-Spondin 1 经常通过调节添加到培养基中。重组 Wnt-3a 很难制备，因此价格昂贵。 R-Spondin 1 并不昂贵，但细胞培养中通常需要高浓度 (0.5-1.0 ug/ml)，这意味着需要大量使用。

考虑到经济上可行的重组蛋白替代品，花费数小时培养细胞和分析条件培养基的科学家可能会改变选择。此外，使用这种方法增加了另一个变量，因为用于调节培养基的细胞会将代谢物分泌到培养基中并耗尽营养物质。实际上，接受培养基的细胞正在获得二手培养基，尽管分泌的生长因子有所改善。

那么有没有更好的解决方案呢？增长因子成本的部分驱动因素是浪费。添加到培养基中的大部分生长因子在到达细胞之前就会降解。对于 3D 培养物来说，这个问题尤其严重，因为细胞被保存在水凝胶中，生长因子无法有效迁移。在 CellGS，我们一直与美国、欧洲和亚洲的实验室合作，研究 PODS的使用 ，以提供更低成本、更有效的条件培养基替代品。

PODS在细胞附近缓慢释放蛋白质，从而减少了需要添加的生长因子的频率，并使可用性曲线变平，减少了细胞的压力，从而提高了细胞的质量。