金纳米粒子的常见应用——使用金纳米颗粒缀合物进行免疫印迹

使用贵金属纳米颗粒缀合物进行免疫印迹

由于制备贵金属纳米颗粒（例如金和银）的抗体缀合物相对容易，并且无需事先开发程序即可通过肉眼直接检测，因此这些探针在许多测定中具有很大的用途。应用包括快速测试，例如横向流动、垂直流动、蛋白质印迹和斑点印迹测定。此外，每种贵金属纳米粒子类型的光学特性 允许生成具有不同颜色的二次探针，可用于比色多重检测，图 1。

当用贵金属蛋白缀合物（例如二级金缀合物）探测印迹蛋白的膜时，在纳米颗粒探针结合后，目标蛋白的存在会以红色指示，如图 1 所示。免疫印迹和斑点印迹应用中的银到结合的金缀合物的灵敏度可与比色检测方法相媲美。此外，二级贵金属纳米颗粒蛋白缀合物很好地适应标准蛋白质印迹方案，并且对您当前的检测方案几乎不需要改变。 

与传统检测探针相比，使用贵金属纳米颗粒蛋白缀合物进行免疫印迹具有多种优势，例如： 

• 检测无需开发

• 检测不需要昂贵的成像设备

• 允许比色多重分析

以下是使用二级金缀合物检测膜上抗原的标准斑点印迹方案。相同的方案可用于金纳米海胆、银纳米颗粒和合金纳米颗粒蛋白质缀合物探针。

标准免疫金斑点印迹实验方案

1. 将 1 微升连续稀释的蛋白质（0.1 – 100 ng）滴在添加有 50 ug/ml BSA 的 PBS 中，滴在硝酸纤维素膜或 PVDF 膜上。

2. 让蛋白质滴干燥进入膜中。

3. 在室温下使用 1% (w/v) 奶粉的 1X PBS 将膜封闭 30 分钟。

4. 与一抗在室温下孵育 2 小时。

5. 用上述制备的封闭液清洗膜 3×5 分钟。

6. 用 0.2% 奶粉按 1:10 (OD=0.3) 稀释的二级金结合物孵育 2 小时（或更长的时间以提高灵敏度）。注意：有关金缀合物的制备，请参阅技术说明#102。

7. 如上所述洗涤 3×5 分钟。

8. 干燥膜并记录数据。

9. （可选）继续进行银增强以提高灵敏度。

图 1. 使用 Cytodiagnostics 膜银增强试剂盒增强前后 Cytodiagnostics 链霉亲和素金缀合物（左上）和我们的链霉亲和素银缀合物（右上）的斑点印迹分析示例。下图展示了使用具有不同光学特性的贵金属纳米粒子缀合物的混合物同时多重检测三种不同抗原，即抗人IgG 30nm金/银(20/80)合金缀合物（绿色）、a-小鼠IgG 30nm金/银 (80/20) 合金缀合物（红色）和 a-兔 IgG 40nm 金缀合物（紫色）。

图 2. 垂直流斑点印迹免疫分析中的多重检测。左图显示 3 个抗原（红点）和对照中的 2 个呈阳性检测。右图显示使用两种不同颜色的纳米颗粒探针（红色：金纳米颗粒，蓝色：金纳米海胆）对两种不同抗原的阳性检测。 

图 3. 使用兔抗肌动蛋白一抗对纯化肌动蛋白进行蛋白质印迹检测，然后使用 10nm 抗兔 IgG 金缀合物进行二次检测，并使用 Cytodiagnostics 膜银增强试剂盒进行增强。 

炔烃修饰的寡核苷酸与染料叠氮化物的缀合

点击化学缓冲液适用于含有炔烃的寡核苷酸的合成后缀合。带有末端炔的寡核苷酸可以使用炔亚磷酰胺合成，或者您也可以在我们的网站上订购修饰寡核苷酸的合成。

叠氮化物与修饰寡核苷酸的末端炔缀合，形成五元杂环。这两个基团（叠氮基和炔烃）在天然生物分子中都极为罕见，因此该反应具有高度特异性，可以有效地处理各种任务。

该反应在铜 (I) 存在下、中性 pH 值下进行。催化缓冲液含有铜 (II)、醋酸三乙铵 pH 7 和 DMSO。建议使用新配制的 抗坏血酸溶液来还原铜 (II)。

对于此反应，您将需要炔烃修饰的寡核苷酸、叠氮化染料、点击化学缓冲液和抗坏血酸。您可以在我们的网站上在线订购所有试剂。

协议

我们推荐以下方案用于含炔寡核苷酸与叠氮化染料的缀合：

1. 根据要使用的寡核苷酸的量确定总反应体积：

   寡核苷酸的量	总反应体积，μL
   4至20纳摩尔	100
   20至40纳摩尔	200
   40至80纳摩尔	400
   80 至 600 纳摩尔	600

2. 使用下表计算标记反应的试剂体积：

   试剂	体积，微升	原液浓度
   叠氮化染料	(寡核苷酸量[nmol])×0.15	10 mM DMSO 溶液
   点击化学缓冲液	（总反应体积[μL]）×0.67	1.5倍
   活化剂 （抗坏血酸）	（总反应体积[μL]）×0.02	50 mM 水中
   水（用于溶解寡核苷酸）	（总反应体积 [μL] – 叠氮化染料溶液的体积 [μL] – 缓冲液的体积 [μL] – 活化剂溶液的体积 [μL]）	—

3. 准备叠氮化染料（DMSO 中 10 mM）和活化剂（抗坏血酸，水中 50 mM） 的储备溶液 。

   请记住，抗坏血酸在空气中很容易氧化。仅使用新配制的活化剂溶液（该溶液在 1 天内稳定）。要制备储备溶液，请将 10 mg抗坏血酸溶解在 1.1 mL 水中。

4. 将寡核苷酸溶解在 2 mL 塑料管中 计算体积的 水中。

5. 添加点击化学缓冲液和涡旋。

6. 添加计算体积的叠 氮化染料储备溶液并再次涡旋。

7. （受到推崇的）。将混合物脱气以除去氧气。为此，将一次性移液器吸头连接到塑料或硅胶管，该管连接到装有惰性气体（氩气、氮气或氦气）的气瓶的压力调节器。打开非常弱的气流并将头部放入管中，使其比液位高 3-10 毫米，避免接触液体和管壁。气流应在液体中形成漩涡而不溅出液体。将头部保持在该位置 10-20 秒。

   如果同时运行多个标记反应，则可以使用 SpeedVac 型系统进行脱气。为此，将管子放入系统中，打开旋转，打开真空 30-40 秒，然后关闭真空，同时向系统输入端注入惰性气体。

8. 添加活化剂溶液（抗坏血酸），然后用惰性气体吹扫管几秒钟并关闭它。

9. 涡旋溶液。如果反应过程中形成沉淀，请将管在热水 (70–95 °C) 中加热，直至沉淀溶解并涡旋溶液。

10. 让混合物在室温下静置 8-16 小时。

11. 添加 2M 高氯酸锂溶液（每 5 体积的反应混合物 1 体积），涡旋溶液，并添加额外的纯丙酮至 2 mL。

12. 摇动管子并使其在-20°C 下静置 20 分钟。

13. 以 10,000 RPM 离心 10 分钟，分离沉淀物。丢弃上清液。

14. 将 1 mL 丙酮添加到沉淀物中。摇动管数次，并以 10,000 RPM 离心 10 分钟分离沉淀物。丢弃上清液。

15. 让沉淀物在室温下在开口管中干燥 1 小时或将管放入 65°C 的加热块中 10 分钟。

16. 将沉淀物溶解于水中，并通过HPLC纯化目标产物

炔烃或叠氮化物修饰的蛋白质与染料叠氮化物或炔烃的缀合

蛋白质标记缓冲液适用于 CuAAC 与蛋白质的反应，可保护生物分子免受活性氧的损害。该反应可用于具有炔烃或叠氮基团的蛋白质，以及用叠氮基团代谢标记的细胞或细胞裂解物的组分。

叠氮化物与末端炔烃缀合，形成五元杂环（1,2,3-三唑）。这两个基团（叠氮基和炔烃）在天然生物分子中都极为罕见，因此该反应具有高度特异性，可以有效地处理各种任务。

该反应在铜 (I) 化合物存在下进行，几乎不依赖于 pH 值。蛋白质标记缓冲液针对蛋白质操作进行了优化，含有铜 (II) 盐（催化活性铜 (I) 化合物的稳定前体）、醋酸三乙铵 pH 6.8、水溶性 THPTA 配体和氨基胍。建议使用新鲜配制的 抗坏血酸溶液减少铜(II)。蛋白质标记缓冲液中的 THPTA 配体通过稳定铜 (I) 的催化活性化合物来加速反应。 THPTA 配体的存在还允许在水介质（无有机溶剂）中进行蛋白质标记，并且由于铜 (I) 氧化程度的稳定，最大限度地减少活性氧 (RAS) 的产生，并防止它们通过氧化组氨酸、蛋氨酸来损坏蛋白质和半胱氨酸。蛋白质标记缓冲液中的氨基胍可防止化学反应性醛（脱氢抗坏血酸水解产物）与精氨酸、N 末端半胱氨酸和赖氨酸的侧链结合。

对于此反应，您将需要无叠氮钠缓冲液中的炔烃或叠氮化物修饰的蛋白质、叠氮染料或 炔烃、1.5х蛋白质标记缓冲液和抗坏血酸。建议在惰性气体（氮气或氩气）下执行步骤 6 至 9。

协议

我们推荐以下方案用于修饰蛋白质与染料衍生物的缀合：

1. 根据要使用的修饰蛋白的量确定总反应体积：

   ！炔烃或叠氮化物修饰的蛋白质溶液的体积不应超过总反应体积的1/3。

   总反应体积，μL	蛋白质含量
   100	4至20纳摩尔
   200	20至40纳摩尔
   400	40至80纳摩尔
   600	80 至 600 纳摩尔

2. 使用下表计算标记反应的试剂体积：

   试剂	体积，微升	原液浓度
   染料叠氮化物或炔烃	（蛋白质含量 [nmol]）× 0.3*	10 mM DMSO 或水
   蛋白质标记缓冲液	（总反应体积[μL]）×0.67	1.5倍
   活化剂（抗坏血酸）	（总反应体积[μL]）×0.02	50 mM 水中
   水	（总反应体积 [μL] – 染料溶液体积 [μL] – 蛋白质标记缓冲液体积 [μL] – 活化剂溶液体积 [μL]）	—

   * 染料过量可能会根据蛋白质分子上叠氮化物或炔基的数量而变化。表中显示的计算结果为 3 倍过量的染料。对于 1.5–10 倍过量的染料，将蛋白质含量 (nmol) 乘以 0.15–1。但请记住，如果您使用不溶于水的叠氮化物或炔烃，则过量时它可能会从反应混合物中沉淀出来。使用水溶性染料，例如磺化花青染料sulfo-Cyanine。

3. 准备 染料叠氮化物或炔烃（10 mM 溶于 DMSO 或水中，适用于水溶性炔烃和叠氮化物）和活化剂（抗坏血酸，50 mM 水溶液）的储备溶液。

   请记住，抗坏血酸在空气中很容易氧化。仅使用新配制的活化剂溶液 （该溶液在 1 天内稳定）。要制备储备溶液，请将 10 mg 抗坏血酸溶解在 1.1 mL 水中。

4. 将蛋白质标记缓冲液添加到修饰的蛋白质溶液中并涡旋。

5. 添加计算体积的叠 氮化染料或炔烃储备溶液，并再次涡旋均匀。

6. （推荐）对混合物进行脱气以除去氧气。为此，将一次性移液器吸头连接到塑料或硅胶管，该管连接到装有惰性气体（氩气或氮气）的气瓶的压力调节器。打开非常弱的气流，放入管中，使其比液面高 3-10 毫米，避免接触液体和管壁。气流应在液体中形成漩涡而不溅出液体。将保持在该位置 10-20 秒。

   如果同时进行多个标记反应，可以使用离心浓缩器进行脱气。为此，将管子放入浓缩器中，打开旋转，打开真空 30-40 秒，然后关闭真空，同时向系统输入端输送惰性气体。

7. 添加活化剂溶液（抗坏血酸），然后用惰性气体吹扫管几秒钟并关闭它。

8. 涡旋溶液。

9. 让混合物在室温下静置 8-16 小时。

10. 使用透析或尺寸排阻色谱分离染料-蛋白质缀合物。