Amplite 胆固醇定量试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测胆固醇的试剂盒，胆固醇是建立和维持细胞膜的重要因素之一。它在生理温度范围内调节膜流动性。在细胞内，胆固醇是几种生化途径中的前体分子。胆固醇也是合成维生素D和类固醇激素的重要前体分子，包括肾上腺激素皮质醇和醛固酮以及性激素黄体酮，雌激素，睾酮及其衍生物。 Amplite 胆固醇定量检测试剂盒是量化胆固醇敏感的方法之一。该试剂盒使用Amplite Red来量化胆固醇浓度，这与胆固醇氧化酶介导的酶偶联反应中胆固醇存在时过氧化氢的产生有关。胆固醇的量与酶偶联反应循环中形成的过氧化氢的浓度成比例。在存在过氧化物酶的情况下，Amplite Red的荧光强度与转化为胆固醇浓度的过氧化氢浓度成比例。用荧光酶标仪可以容易地读取测定法。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 胆固醇定量试剂盒。 

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样品实验方案

简要概述

准备胆固醇检测工作溶液（50μL）
添加胆固醇标准品和/或测试样品（50μL）
在37°C孵育30分钟
在Ex / Em = 540 / 590nm处监测荧光强度

溶液配制

1.储备溶液配制

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1.1 Amplite 红色储备液（250X）：
将40μLDMSO（组分E）加入到Amplite Red底物（组分A）的小瓶中。应立即使用原液。任何剩余的溶液应等分并在-20℃重新冷冻。注意：避免反复冻融循环。注意：在硫醇如二硫苏糖醇（DTT）和2-巯基乙醇存在下，Amplite Red底物不稳定。反应中DTT或2-巯基乙醇的浓度应不高于10μM。 Amplite Red底物在高pH（> 8.5）下也不稳定。因此，反应应在pH 7-8下进行。建议使用提供的分析缓冲液（pH 7.4）。

1.2胆固醇标准储备液（20μM）：
将10μL胆固醇标准品（组分D）加入990μL测定缓冲液（组分B）中并充分混合。

2.标准溶液配制

2.1胆固醇标准溶液配制
准备胆固醇标准品（20μM）。 然后在测定缓冲液（组分B）中进行1：3连续稀释，得到约10,3,1,0.3,0.1,0.03和0.01μM系列稀释的胆固醇标准品。 包括非胆固醇缓冲液对照作为空白对照。

3.工作溶液配制

胆固醇工作溶液配制：
将5mL测定缓冲液（组分B）加入胆固醇酶混合物（组分C）的瓶中，并充分混合。 在胆固醇酶混合瓶中加入20μLDipiteRed 储备液（250X）。

操作步骤

表1.固体黑色96孔微孔板中胆固醇标准品和测试样品的布局。

CS =胆固醇标准（CS1-CS7）; BL =空白对照; TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成

胆固醇测定

1.如表1和2中所述，将胆固醇标准品和含有胆固醇的测试样品加入到96孔黑色微孔板中。

2.将50μL胆固醇测定工作溶液加入胆固醇标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（表2），使总胆固醇测定体积为100μL/孔。 注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μL测定反应混合物。

3.将反应在37℃孵育30分钟，避光。

4.用荧光板读数器在Ex / Em = 530-570nm / 590-600nm（Ex / Em = 540 / 590nm）监测荧光强度。 注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

数据分析

        从空白标准孔获得的读数（RFU）用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。 然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。 该等式可用于计算胆固醇样品。 点击使用在线线性回归计算器。

图1.使用Gemini荧光酶标仪（分子装置），在黑色96孔板中用Amplite 荧光胆固醇定量试剂盒测量胆固醇剂量反应。 孵育30分钟可检测到低至0.03μM的胆固醇（n = 3）。

参考文献

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Hypermethylation of the TGF-β target, ABCA1 is associated with poor prognosis in ovarian cancer patients
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