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如何为 ELISA 试剂盒制备细胞或组织裂解物。

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如何为 ELISA 试剂盒制备细胞或组织裂解物。

为 ELISA 试剂盒制备细胞或组织裂解物

与 RayBio ® ELISA 试剂盒一起使用的细胞或组织裂解液可以使用大多数常规方法来制备，例如在RayBio® 裂解缓冲液中匀浆细胞或组织。您还可以使用自己的裂解缓冲液，例如 RIPA 或其他针对免疫沉淀优化的配方。

请注意以下有关裂解缓冲液成分的指南：

  1. 避免使用 >0.1% SDS 或其他强变性洗涤剂。一般来说，非离子型去污剂（如 Triton X-100 或 NP-40）是好的，但两性离子型去污剂（如 CHAPS）或温和的离子型去污剂（如脱氧胆酸钠）也可以。

  2. 总洗涤剂用量不超过 2% v/v

  3. 避免使用叠氮hua钠

  4. 避免使用 >10 mM 还原剂，例如二硫苏糖醇或巯基乙醇

我们强烈建议在均质化之前向裂解缓冲液中添加蛋白酶抑制剂混合物。大多数通用生化供应公司（包括 Roche、Sigma-Aldrich、Pierce 和 Calbiochem）都备有多种此类产品。由于对蛋白水解的敏感性和裂解液中存在的蛋白酶类型各不相同，因此我们不推荐特定的产品。相反，您选择使用哪种蛋白酶抑制剂组合应基于对您感兴趣的蛋白质和/或组织或细胞类型的文献检索。可以使用磷酸酶抑制剂，但不是必需的，除非试剂盒中使用的抗体特异性识别蛋白质的磷酸化形式。

裂解和匀浆方法的选择包括玻璃珠“粉碎”、粉碎、冻融、超声处理和用研钵和杵粉碎冷冻组织，甚至这些方法的组合。没有适用于所有样本类型的最佳方法；您应该在简要搜索文献后选择方法，以了解在以前的调查中如何准备与您相似的样本。

均质化后，离心裂解物以去除细胞/组织碎片（5 分钟 @ 10,000 xg 或 10 分钟 @ 5,000 xg）并保存上清液。除非新鲜测试，否则裂解物应尽快冷冻并储存在 -20°C（或 -80°C，如果可能）下。在进行任何免疫测定孵育之前再次离心。接下来，使用不受去垢剂抑制的总蛋白测定（例如二辛可宁酸 (BCA) 测定）确定裂解物的蛋白质浓度，并标准化每个样品的体积，以便为每个测定提供相同量的总蛋白。

注意：不建议使用 Bradford 测定法，因为它可能会因洗涤剂的存在而受到抑制。

由于不同的细胞和组织可能含有不同量的蛋白质，作为起点，我们建议每 1×10 6 个细胞或 10 mg 组织使用 500 µL 裂解缓冲液。您可能需要根据您的结果进行调整。匀浆的目标总蛋白浓度应至少为 1,000 µg/mL，但 2,000 µg/mL 或更高会更好。

无论您拥有哪种样品类型，强烈建议您在制备后对所有样品进行分装，以大程度地减少多次冻融循环造成的蛋白质降解。这也确保了进一步实验的样品的可用性。

哺乳动物细胞裂解物中 GFP 融合蛋白的免疫沉淀 (IP/CoIP) 方案

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哺乳动物细胞裂解物中 GFP 融合蛋白的免疫沉淀 (IP/CoIP) 方案

哺乳动物细胞裂解物中 GFP 融合蛋白的免疫沉淀 (IP/CoIP) 方案

该方案旨在对 GFP 标记的融合蛋白进行免疫沉淀，以通过蛋白质免疫印迹或活性测定进行分析。
溶液和试剂
1X 细胞裂解缓冲液：50 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100。建议在使用前添加 1 mM PMSF。
1X 洗涤缓冲液：TBS（50 mM Tris HCl，150 mM NaCl，pH 7.5）
5X SDS 上样缓冲液
1. 准备细胞裂解物
1. 要在非变性条件下收获细胞，去除培养基并用冰冷的 PBS 冲洗细胞一次。去除 PBS 并向每个板（10 cm，106-107 个细胞）中加入 0.5 mL-1mL 1X 冰冷细胞裂解缓冲液（添加蛋白酶抑制剂混合物和 PMSF），并将板在冰上孵育 30-40 分钟，4 °旋转摄氏度。
2. 从平板上刮下裂解的细胞并转移到微量离心管中。继续冰上。
3. 在冰上对样品进行超声处理 3 次，每次 5 秒（可选步骤）。
4. 4°C、14,000 xg 微量离心 10 分钟，将上清液转移到新管中。如有必要，可将裂解物储存在 –80°C 下。
注意：如果目的蛋白是核蛋白，请使用RIPA裂解液裂解细胞，并加入PIC、1mM PMSF、2.5mM Mgcl2和1mg/ml DNase I。
2. 平衡珠子
1. 颠倒产品管或轻轻上下吹打以重悬珠子。不要涡旋珠子。
2. 吸取 25 µL 珠浆到 EP 管（1.5 mL）中，然后加入 1 mL 冰冷的洗涤缓冲液。用手轻轻摇晃 1-2 分钟。不要涡旋珠子。
3、磁选60秒。
4. 弃去上清，重复洗涤 3 次。
3. 免疫沉淀
1. 取 500 μL 细胞裂解液，加入 25 μL 抗体偶联磁珠悬液，4°C 孵育 1-3 小时或 4°C 过夜。
4. 清洗蛋白质-纳米抗体-珠复合体
注意：如果研究了 Co-IP 相互作用的蛋白质，请减少洗涤次数，并降低洗涤缓冲液的离子强度。
加入 1.0 mL 的 Wash Buffer 并悬浮珠子复合物，磁选，然后弃去上清液。重复上述步骤至少四次。
5. 下游分析的洗脱
GFP 融合蛋白的洗脱-根据蛋白质特性或进一步用途推荐两种洗脱方法：
选项 A：天然洗脱
在酸性条件下用 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5) 洗脱。这是一种快速有效的洗脱方法。用中和缓冲液（1 M Tris，pH 10.4）中和洗脱的蛋白质可能有助于保持其活性。中和缓冲液需要预先放入收集管中。
注意：需提前做初步实验，确定中和甘氨酸（PH 2.5）需要多少中和缓冲液
选项 B：SDS-PAGE 的变性洗脱
在凝胶电泳和免疫印迹的变性条件下用样品上样缓冲液洗脱。
A：用 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5) 洗脱 – 该过程应在室温下进行。
注意：不要将珠子留在该缓冲液中超过 20 分钟。
1. 向每个样品和对照珠复合物中加入 50 µL 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5)。
2. 在 4°C 下轻轻摇动或在旋转器上孵育样品和对照 5-10 分钟。
3. 将试管放入磁力分离器中以收集珠子。将上清液转移到含有 25-35 μL 中和缓冲液的新管中。小心不要转移任何珠子。
4. 重复步骤 1-3 以提高洗脱效率，将洗脱液集中在同一管中或通过不同管收集洗脱液。
6. 如需立即使用，请将洗脱液储存在 2-8 °C。储存在 –20 °C 以进行长期储存。
B：用 SDS-PAGE 上样缓冲液洗脱
1. 用 30 µL 1X SDS 样品上样缓冲液重悬每个样品（6 µL 5X SDS 样品上样缓冲液可以添加到 24 µL 细胞裂解缓冲液中）。涡流。
2. 在 95 – 100°C 下将样品管和对照管煮沸 10 分钟。
3. 将试管放入磁力分离器中以收集珠子。将上清液转移到新管中。样品和对照已准备好加载到 SDS-PAGE 上，并使用抗 GFP 或针对融合蛋白的特异性抗体进行免疫印迹。