lumafuor高效retrobeads操作说明
一、包装及稀释：
Lumafuor 的珠子装在密封小瓶中，并将浓缩的珠子悬浮在蒸馏水中。如果使用红色微珠作为神经通路的逆向示踪，推荐稀释方法：大鼠视觉皮层可采用1:4稀释，且不会降低微珠荧光标记的强度和质量。但对于第一次实验，我们不建议使用稀释的微珠，而是使用原液进行进样示踪。除蒸馏水外，也可使用常规盐溶液如 NaCl 和 KCl 作为稀释剂。如果使用绿色珠子，强烈建议使用原液而不需稀释。
二、储存：
为了避免蒸发，珠溶液应保存在4度冰箱中。不要冷冻它！冷冻的豆子将毫无用处，无法使用。干燥后的珠子也不能使用（不能重新悬浮），产品没有明显的使用寿命。如果按要求保存，可保存数年。
三、注射：
珠子最好使用压力注射，如1ml Hamilton 微量注射器或气动注射系统。如需小面积显微注射（30-50nl），可采用末端直径为30-50um的玻璃电极进行注射，而较大直径的玻璃电极可用于常规反向示踪（注射量0.1-0.3ul）。然而，即使剂量较高，珠子也不会从注射部位显着扩散（通常小于 1 毫米）。因此，为了尽可能完整地标记投射到更大核的神经元，需要多点注射。尽管珠子带负电，但不建议将离子渗透法用于示踪珠子。
4、生存时间：
在大多数恒温脊椎动物系统中，检测珠子的最短有效时间是24小时。 48小时内，标记强度随进样时间增加而增加，48小时后荧光强度保持恒定。对于冷血动物，建议检测珠子的时间为 1 周。目前尚未检测出珠子的最长可检测周期。然而，珠子的荧光强度和质量可以在体内至少14个月保持不变，并且细胞可能被长时间标记。尚未发现珠子对动物或神经元有毒性作用。
五、固定及处理：
标准固定方法是：0.1mpbs洗涤或灌注并固定在4%多聚甲醛中（0.1mpbs制剂，pH7.4）。用戊二醛固定会产生大量的组织自发荧光，这会阻碍珠子标记的神经元。而且戊二醛固定的组织中不会全观察到绿色珠子，因此应尽量避免。如果使用冷冻切片，则应使用 PBS 冲洗切片并用明胶包被的载玻片干燥。风干后，载玻片应用二甲苯放置 1 分钟透明，然后用荧光封片或 krystalon 密封。 Fluoromount可以从atomrgic chemetals Corp. (Farmingdale, NY)购买；克里斯塔隆可以从
Harleco（EM Industries，新泽西州吉布斯敦）。切片只能短时间接触乙醇或二甲苯，但长期接触（超过 5 分钟）会损坏珠子。微珠对甘油非常敏感，在甘油环境中荧光会很快被提取。因此，不宜使用甘油封孔剂。如果无法避免，可用水杨酸甲酯代替甘油作为封闭剂。如果将切片保存在黑暗环境中，荧光珠标记的细胞一年内无法提取（但切片的荧光背景会增加）。到目前为止，还没有珠子标记的组织涂有塑料材料的记录。
观察：
红珠中的染料是罗丹明，所以所有与罗丹明配套的荧光滤光片都可以使用。尼康公司一些旧的罗丹明滤光片由于背景较高，可能无法观察到荧光珠。一般情况下，蔡司、徕兹的标准罗丹明滤光片可以获得较好的观察效果。大多数绿色荧光滤光片都可以很好地观察绿豆的荧光结果。设置为荧光黄的滤光片可以获得强烈明亮的荧光，但也带来较高的背景干扰。结果表明，较宽波段的荧光滤光片比窄带滤光片可以获得更强的荧光信号。经过长时间的观察和拍照，珠子的荧光没有出现。
