使用 dsGreen 染料进行 qPCR
如果 dsGreen 试剂储存温度低于 20 °С，请将其解冻并保存在室温下。为了快速解冻，可将试剂加热至 50 °С。
根据 PCR 试剂制造商的说明计算反应所需试剂的体积。请注意，dsGreen（库存 100х）必须在 PCR 主混合物中稀释至最高 1 倍浓度。
根据 PCR 试剂制造商的说明制备不含 DNA 的 1x 主混合物，添加必要量的 dsGreen。如果您使用不带热启动的 Taq 聚合酶，请将预混液和 PCR 管放在冰上。
将主混合物转移至管或板中并添加 DNA。
根据您的仪器制造商的说明继续进行放大。
qPCR 实验中始终包含阳性和阴性对照。 qPCR 扩增的温度程序与给定模板和引物的标准 PCR 程序没有区别。对于检测，应使用 FAM 通道。为了能够区分特定产物和引物二聚体，请在 PCR 程序中使用熔解曲线步骤。
使用 Pico488 进行 DNA 定量
Pico488 DNA 定量溶液是一种超灵敏试剂，用于在无法通过测量 260 nm 吸光度来确定双链 DNA 浓度时测量双链 DNA 浓度。 Pico488 选择性地结合双链 DNA，因此核苷酸、单链 DNA、RNA、蛋白质和其他杂质不会妨碍测量。与双链 DNA 结合的染料在 503 nm 处最大吸收光并在 525 nm 处最大发射光。为了检测测定读数，可以使用任何类型的荧光计或荧光板读数器。
Pico488 测量 DNA 浓度的线性范围为 1 pg/μL — 5 ng/μL。为了实现精确、可重复的荧光测量，我们建议在 TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA）中稀释 DNA 和 Pico488。为了计算 DNA 浓度，我们建议首先使用一系列 DNA 标准稀释液建立校准曲线。
Lumprobe 销售各种包装的Pico488 DNA 定量溶液和Pico488 DNA 定量试剂盒。除了 Pico488 溶液之外，该试剂盒还包括缓冲液和 DNA 标准储备溶液。如果测定体积等于 2 ml，则试剂盒提供的染料溶液量足以分析标准荧光比色皿（体积 3.5 ml）中的 200 个实验数据点。如果使用其他类型的设备来检测荧光，则可以重新调整测定范围。下表提供了常用荧光设备的推荐检测体积。
解冻 Pico488 染料瓶中的内容物，充分混合，并用缓冲液将所需量的 Pico488 染料溶液稀释 200 倍（我们建议使用 10 mM Тris HCl、1 mM EDTA，pH 7.5）。混合并在3小时内使用。每个实验数据点的 Pico488 工作溶液体积应等于测定体积的 50%（查看下表以查找适合您的荧光测定设备类型的推荐体积）。为所有实验数据点（针对您计划分析的所有样品和所有 DNA 标准稀释液）准备足够的 Pico488 工作溶液。还包括额外 10-25% 的 Pico488 工作溶液体积，以排除可能的移液错误。要计算稀释后的 Pico448 的体积，可以使用以下公式：
V Pico488 = 5/8 × V测定× (N 个样品+ N 个标准品)， 其中 V测定是样品或标准品的测定体积，mL，N 个样品 是您计划分析的样品数量，N 个标准品是您计划分析的标准品数量（包括空白样品）。
在缓冲液中稀释 DNA 样本，使溶液体积等于测定体积的 50%（您可以使用任意量的 DNA）。添加等体积的 Pico488 工作溶液。混合并孵育 5 分钟。同样，制备 DNA 标准品的稀释液。请注意，DNA 标准品的稀释度应在样品中 DNA 浓度的范围内。 DNA 标准储备液仅随Pico488 DNA 定量试剂盒提供。Pico488 DNA 定量解决方案的用户 应使用自己的 DNA 标准品。
使用Pico488 DNA 定量溶液进行 DNA 定量的推荐体积：
| 设备类型 | 测定体积 | 稀释后的 Pico488 体积 | 稀释 DNA 体积 |
|---|---|---|---|
| 标准荧光比色皿（3.5 ml） | 2毫升 | 1毫升 | 1毫升 |
| 其他荧光比色皿 | 约比色皿体积的 75% | 比色皿体积的 37.5% | 比色皿体积的 37.5% |
| 96 孔板*，每孔 | 0.2毫升 | 0.1毫升 | 0.1毫升 |
| 24 孔板，每孔 | 1毫升 | 0.5毫升 | 0.5毫升 |
| 其他板材 | 约占井容积的75% | 井体积的37.5% | 井体积的37.5% |
| NanoDrop™ 3300* | 0.1毫升 | 0.05毫升 | 0.05毫升 |
* 为了保持测量的准确性和精密度，我们建议避免移液量低于 2 µL。
使用适当的吸收和发射波长或滤光片测量标准和样品 DNA 溶液的荧光（双链 DNA 结合的 Pico488 染料吸收最大波长为 503 nm 的光，发射最大波长为 525 nm 的光）。
绘制荧光与 浓度的关系图，并在任何软件中应用线性回归函数，以获得反映荧光 ( FL ) 与浓度 ( C ) 依赖性的线性方程：
FL = A × C + B。
要计算稀释样品中的 DNA 浓度，请使用以下公式：
C样品= (FL样品 — B)/A，其中FL样品是样品溶液荧光。
要计算未稀释样品中的 DNA 浓度，请使用以下公式：
С init = V Assay × C Sample / V init，其中 V Assay是测定体积（mL），V init是初始 DNA 样品的体积（μL）
或者，您可以使用我们的dsDNA 定量和稀释 计算器完成所有必要的计算。
如何进行ELISA的构建？
应选择具有已知分析物浓度的标准样品，以涵盖从检测下限到上限（校准）的整个测定范围。这是为了确保无论样品中可测量的分析物浓度较低还是较高，测定的灵敏度和精确度都是一致的。此外，患者样本应取自并包含各种年龄范围、种族、性别和健康状况，以确保检测的广泛适用性和可靠的结果。在定量之前和定量过程中保持目标分析物稳定对于准确测定浓度至关重要。因此，样品提取、制备和储存中涉及的以下分析前条件尤其重要。
必须选择能够保持分析物稳定性的适当样品基质。
可能需要将蛋白酶抑制剂添加到生物流体样品基质中，以防止天然存在的蛋白酶降解分析物。
收集患者样本时，必须评估运动、禁食、酒精、烟草和季节变化的影响。
必须确定最佳样品储存温度（-80° C、-20° C、2-8° C 或室温）和冻融循环次数
必须研究样品在室温下放置并在检测环境中保持稳定的时间长度。
移液前必须以标准化方式充分混合或倒置样品，以确保分析物在整个样品基质中均匀分布。
洗涤缓冲液的目的是洗掉任何未结合或过量的物质，否则可能会产生背景噪音信号并干扰测定和结果。洗涤缓冲液的设计具有与生理条件相似的 pH 值和盐浓度，并含有TRIS ( FT15751 )、PBS 和聚山梨酯等洗涤剂。如果检测到大量“背景噪音”而不是信号强度，则增加洗涤缓冲液的体积、洗涤剂的浓度或/和洗涤步骤的数量通常会有所帮助。这将增加所有未结合材料被去除的可能性。如果怀疑分析物降解或者分析物在程序中被洗掉，则减少洗涤步骤数、洗涤缓冲液体积或缓冲液中去污剂的浓度可能是有益的。
为了防止与其他检测成分发生交叉反应和非特异性抗原结合，需要使用封闭剂。通常将牛奶溶液（脱脂奶粉）、全血清或牛血清白蛋白 (BSA) ( PRO-422 ) 等试剂添加到缓冲液中，并在第一次洗涤步骤后使用，以饱和孔的自由表面。
这种封闭缓冲液也可以含有去污剂，但应避免使用可能干扰测定的生物素或免疫球蛋白等成分。总体封闭缓冲液可以获得更高的信噪比，并且可以在使用的封闭剂的体积、浓度和类型方面进行优化。
常用的信号系统之一是酶联抗体，并且有多种不同形式和物种类型可供选择。常用于 ELISA，其中碱性磷酸酶和磷酸对硝基苯酯底物在目标分析物存在的情况下会产生黄色。检测抗体还可以与过氧化物酶并与氨基水杨酸和邻苯二胺底物一起使用，如果出现阳性结果，它们会呈现棕色。总体酶反应用于证明反应的特异性和速率。信号出现后，可以添加氢氧化钠、盐酸或硫酸来终止反应。
在测定开发过程中，性能和财务方面在确定应使用哪些试剂以及浓度时起着关键作用。虽然使用较低浓度的酶联抗体可能更具成本效益，但可能有必要增加浓度以确保产生足够的信号强度。如果您的 ELISA 灵敏度较差，可以通过改变抗体类型（从单克隆抗体到多克隆抗体）或采用不同的信号系统来放大信号。第一个例子是二抗被生物素化，然后添加链霉亲和素-HRP。由于四个链霉亲和素分子可以与生物素相互作用，因此通过添加更多的链霉亲和素分子进行检测，可以提高检测少量分析物的能力。此外，通过用多种酶、银纳米颗粒标记检测抗体或使用化学发光或荧光底物等替代底物类型，可以提高灵敏度。
标准曲线或校准曲线由分布在测定范围内的已知分析物浓度的样品组成。它们在 ELISA 中用作辅助，以便稍后计算目标分子的浓度。应该强调的是，校准品和对照品的矩阵应尽可能与所运行的天然样品的矩阵相似。
运行标准曲线很有用，如果生成的标准曲线较差，可能会导致结果无效或突出检测中的错误。不正确的抗体结合或分析物捕获可能是标准曲线不良的原因。除了校准曲线外，还应使用阳性和阴性对照样品。阴性对照不应包含任何感兴趣分析物的痕迹，因为它们用于检查假阳性和非特异性结合。阳性对照应含有已知浓度的目标分析物。如果测定检测到阳性对照中存在分析物并且阴性对照均为阴性，则测定工作可靠且结果有效。
使用已知浓度的校准品创建的 ELISA 标准曲线示例，X 表明通过曲线插值获得的未知样品的浓度。
尝试并使用 ELISA 的特定孵育时间和温度，有助于在捕获抗体和目标分析物之间达到结合平衡。控制板周围温度的一种方法是使用确保波动最小的培养箱。此外，使用混合器可以帮助您的 ELISA 达到最佳性能，因为它有助于将试剂分布在整个基质中，以促进更多的结合。一般来说，较长的潜伏期可能有利于灵敏度，因为有更多的时间进行结合。然而，还应该测试缩短的孵育时间。
当捕获抗体固定到 ELISA 板上时，其方向可能会发生变化，从而降低其亲和力以及与抗原结合的机会。此外，洗涤步骤中抗体的置换可能导致灵敏度和重现性较差。解决这个问题的一种方法是使用单层表面，使抗体能够共价结合到板上，但 Tania García-Maceira 等人已经证明了灵敏度的更大改进。 （2020）通过使用甲壳素涂层的聚苯乙烯表面来实现。使用这种固定形式，抗体通过与几丁质结合域融合，以更好的方向被捕获到微量滴定板上。
如何进行土壤电导率的测定
土壤电导率（soil conductivity）指土壤传导电流的能力，通过测定土壤提取液的电导率来表示。测定结果单位以mS/m（即10μS/cm）表示。当测定结果大于或等于100mS/m（即1000μS/cm）时，保留三位有效数字；当测定结果小于100mS/m时，保留至小数点后一位。
土壤电导率是土壤提取液中的阴离子和阳离子的总和，代表了土壤的含盐量。测定土壤的电导率可以直接反应出土壤混合盐的含量，对于确定各种田间参数时空分布的差异有重大意义，从而也为基于信息和知识的现代精细农业的普及推广打下基础。
原理
国家标准HJ 802-2016《土壤 电导率的测定 电极法》给出了土壤电导率的测定方法，要求取自然风干的土壤样品，以 1:5（m/V）的比例加入水（电导率不高于0.2mS/m，即2μS/cm），在 20℃±1℃的条件下振荡提取，然后用电导率仪测定 25℃±1℃条件下提取液的电导率。需要注意的是，当待测土壤的提取液电导率小于1mS/m（即10μS/cm）时，空气中的二氧化碳和氨对电导率的测定影响较大，在封闭的小空间中进行操作，可消除或降低其干扰。
方法
（1）样品准备
● 按照HJ/ T 166的相关规定采集、制备和保存样品。
（2）标定
● 配置电导率标准溶液或使用市售电导率标准溶液
● 使用电导率标准溶液校正电导率仪
（3）样品制备
● 称取 20.00 g 土壤样品于 250 ml 振荡瓶中，加入 20℃±1℃的 100 ml水，盖上瓶盖，放在往复式水平恒温振荡器上，于 20℃±1℃振荡 30 min。静置 30 min 后，过滤或离心，提取液收集于100 ml 烧杯中，待测。
● 相同的步骤做空白试样
（4）测量
● 用水冲洗电极数次，再用待测的提取液冲洗电极。将电极插入待测提取液，按照电导率仪的使用说明书要求，将温度校正为25℃±1℃，测定土壤提取液的电导率。直接从电导率仪上读取电导率值，同时记录提取液的温度。
● 相同的步骤测试空白试样。空白电导率值不应超过1mS/m（即10μS/cm）。否则，应查找原因，重新测定。
● 记录测定结果。
四、仪器及配件推荐
对细胞进行铺板要进行哪些操作
进行细胞计数时要进行哪些步骤