酶法金相学：一种简单的新染色方法

将有机底物酶促转化为深色、不溶性反应产物被广泛用作免疫组织化学中的检测方法[1]，并且也已用于原位杂交检测[2]。尽管应用广泛，但它并不适合所有应用。产品的扩散可能会限制分辨率，并且染色的连续性可能会掩盖底层的细胞结构。与其他细胞染色剂的对比度可能低于预期，最近开发的镍基增强试剂已经解决了这个问题，该试剂与二氨基联苯胺反应产物结合，产生较暗的信号[3]。某些应用还需要比直接酶染色更高的灵敏度；这通常是通过聚合酶链式反应等扩增方法 [4] 或半抗原化底物（例如生物素化酪胺）的催化沉积来实现的[5]。然而，这大大增加了程序的长度和复杂性，并且还可能受到扩增产物的扩散的影响。

我们发现，在适当的金属源和活化剂存在的情况下，辣根过氧化物酶缀合的探针可以选择性地沉积金属，从而产生黑色的、高度局部化的染色。图 1-4 所示结果显示了新型金相基质与传统 DAB 开发在人类乳腺癌中的比较。将石蜡切片在二甲苯中脱蜡、水合并使用蒸汽热进行 HIER（抗原修复）30 分钟。用3% H ₂ O ₂封闭内源性过氧化物酶后溶液5分钟，切片与一抗孵育30分钟，随后与Envison检测试剂盒(Dako Corp)孵育30分钟。对照（图 1 和 3）用 DAB 显色剂染色 5 分钟，并用苏木精复染 2 分钟；实验切片（图 2 和 4）用金相基质处理 7-8 分钟，并用甲基绿复染。与 DAB 相比，染色的点状性质和非常低的背景结合程度是显而易见的。该方法还被发现对原位杂交检测高度敏感（图 5），并且在平行免疫印迹中产生的染色比 DAB 染色深得多（图 6）。

图 1 和图 2：对乳腺浸润性导管癌进行黄体酮受体（单克隆抗体 PR-88）染色，然后进行 (1) DAB 或 (2) 酶金相分析（条 = 50 微米）。

图 3 和 4：乳腺导管内粉刺癌，使用多克隆 c-erb-B2 一抗对 Her 2/neu 进行染色，然后进行 (3) DAB 或 (4) 酶金相分析（条 = 25 m）。

图5：中等扩增对照细胞系（4-6个拷贝）中Her-2/neu的原位杂交检测；每个点对应于该基因的一次出现。使用链霉亲和素、辣根过氧化物酶和金属沉积混合物检测的生物素化探针（放大倍数 x 1,000）。

图 6：（上）使用辣根过氧化物酶的新金相底物开发的免疫印迹。将2微克HRP沉积到硝化纤维素上，用4％BSA封闭，然后用金相基质处理； （底部）使用标准 DAB 开发的相同目标。