用 BDP 标记的神经酰胺对高尔基体进行染色

神经酰胺是鞘脂的前体，由鞘氨醇和脂肪酸通过酰胺键连接而成。 BDP 神经酰胺是合成的荧光脂质，是 BDP 荧光团与鞘氨醇的缀合物。在细胞内部，BDP 神经酰胺融入高尔基体膜中，因此这些染色剂广泛用于细胞生物学，通过荧光显微镜观察活细胞和固定细胞中的高尔基体。

溶液的制备

1.1 库存解决方案

BDP FL 神经酰胺：

• 将 50 μg BDP FL 神经酰胺溶解在 87.2 μL DMSO 中，以获得 1 mM 储备溶液。

• 将 250 μg BDP FL 神经酰胺溶解在 436 μL DMSO 中，以获得 1 mM 储备溶液。

BDP TMR 神经酰胺：

• 将 50 μg BDP TMR 神经酰胺溶解在 73.6 μL DMSO 中，以获得 1 mM 储备溶液。

• 将 250 μg BDP TMR 神经酰胺溶解在 368 μL DMSO 中，以获得 1 mM 储备溶液。

BDP TR 神经酰胺：

• 将 50 μg BDP TR 神经酰胺溶解在 70.8 μL DMSO 中，以获得 1 mM 储备溶液。

• 将 250 μg BDP TR 神经酰胺溶解在 354 μL DMSO 中，以获得 1 mM 储备溶液。

将储备溶液储存在-20°C或-80°C避光条件下。避免反复冻融循环。

1.2 染色液

1. 将 10 mL 的 Hanks 缓冲盐溶液与 10 mM HEPES (HBSS/HEPES)、pH 7.4 测量到 50 mL 塑料管中。其他无血清平衡盐溶液，例如 PBS，也适用于此目的。

（可选）将 1 mM Ca 2+和 0.5 mM Mg 2+添加到缓冲溶液中，以防止活细胞聚集并从玻璃上分离。

2. 在装有缓冲液的试管中添加 3.4 mg (0.34 mg/mL) 脱脂 BSA。

3. 添加 200 µL 1 mM 神经酰胺库存溶液，以获得 5 µM 神经酰胺/5 µM BSA 工作溶液。神经酰胺的稀释取决于细胞类型和密度，应通过实验确定。

所得神经酰胺/BSA复合物溶液可在-20°C下储存在塑料瓶中。

细胞染色

2.1 活细胞

1. 在无菌盖玻片上培养细胞。贴壁细胞可以直接在盖玻片上染色。

2. 从盖玻片中吸出介质。

3. 用适当的介质（例如 HBSS/HEPES）冲洗细胞。

4. 将细胞与 5 µM 神经酰胺/BSA 溶液在 4°C 下孵育 30 分钟。

5. 用冰冷的培养基冲洗细胞几次。

6. 用脱脂 BSA (0.34 mg/ml) 的 HBSS/HEPES 溶液在室温下冲洗细胞四次，持续 30 分钟。

7. 将细胞在新鲜培养基中于 37°C 进一步孵育 30 分钟。

8. 用新鲜培养基冲洗细胞。

9. （可选）染色细胞可在 4% 甲醛中于 4 °C 固定 2 分钟。在 PBS 中清洗固定细胞两次。

10. 对于荧光显微镜，将带有染色细胞的盖玻片翻转到载玻片上，将它们放置在载玻片和盖玻片之间。

2.2 固定单元格

1. 4°C 下将细胞固定在 4% 甲醛中 5 分钟。

2. 固定细胞用 PBS 清洗两次，每次 5 分钟。

3. 将细胞与 PBS 中的 5 µM 神经酰胺/BSA 在 4°C 下孵育 30 分钟。

4. 用脱脂 BSA (0.34 mg/ml) 的 PBS 溶液在室温下冲洗细胞四次，持续 30 分钟。

5. 在 PBS 中冲洗细胞两次。

6. 对于荧光显微镜，使用封固剂将细胞封固在盖玻片下 。