钙离子荧光探针Cal-590 AM是美国AAT Bioquest生产的钙离子荧光探针，Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630提供强大的均匀荧光测定工具，用于检测细胞内钙动员。与现有的钙指示剂（如Fluo-3 AM，Fluo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，这些钙敏感染料明显更亮，并提供更高的信噪比，大大提高了细胞内保留和负载效率。表达通过钙发出信号的GPCR或钙通道的细胞可以预装载可以穿过细胞膜的Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM。一旦进入细胞内，Cal520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM的亲脂性阻断AM基团被细胞内酯酶切割，产生带负电荷的荧光Calbryte 染料，留在细胞内。它们与钙结合后的荧光大大增强。当用激动剂刺激细胞时，该受体表示细胞内钙的释放，这显着增加了Calbryte 520，Calbryte 590或Calbryte 630的荧光。高灵敏度和> 100倍荧光增强的特性使Calbryte 520 AM， Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM是测量细胞内钙的强大指标。

除了方便的激发波长和钙的大荧光增强外，Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630主要定位于细胞溶胶中，不像Rhod-2主要位于线粒体中。 此外，Calbryte 590和Calbryte 630的长Ex / Em波长使这些染料成为钙指示剂，可与绿色荧光蛋白（GFP）细胞系进行多色检测。 此外，Calbryte 520，Calbryte 590或Calbryte 630钙测定经过优化，可与大多数现有荧光仪器兼容。 Calbryte 520可在488 nm处激发，并与FITC滤光片组配合使用。 Calbryte 590经过优化，可在555 nm激发，并与TRITC / Cy3滤光片组配合使用。 Calbryte 630经过优化，可在594 nm激发，并与TexasRed®滤光片组配合使用。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的钙离子荧光探针。 

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钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

使用Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM酯类

1.操作步骤

        Calbryte AM酯应在使用前在无水DMSO中重新配制。 DMSO储备溶液可以在-20℃下储存（干燥）并避光。 在这些条件下，AM酯应稳定三个月。 以下是我们推荐的将Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM酯加入活细胞的方案。 该方案仅提供指南，实际应根据您的特定需求进行修改。

a）在无水DMSO中制备2至5mM Calbryte 520AM，Calbryte 590AM或Calbryte 630AM酯的储备溶液。

b）将Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。 在Hanks和Hepes缓冲液（HHBS）或您选择的缓冲液（0.04％Pluronic®F-127）中制备10至20μM的染料工作溶液。 细胞加载所需指示剂的确切浓度必须根据经验确定。

注意：非离子型洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM酯的水溶性。 各种Pluronic®F-127可从金畔购买。

c）如果您的细胞（如CHO细胞）含有有机阴离子转运蛋白，可将丙磺舒（1-2 mM）添加到染料工作溶液中（浓度为0.5-1 mM）

注意：各种ReadiUse 丙磺舒（包括水溶性钠盐和稳定溶液）均可从金畔购买。

d）将等体积的染料工作溶液（来自步骤b或c）加入细胞板中。

e）将染料加载板在细胞培养箱中孵育约60分钟，然后将板在室温下再孵育15分钟。

f）用HHBS或您选择的含有阴离子转运蛋白抑制剂（如1 mM丙磺舒）的缓冲液替换染料工作溶液，以去除多余的探针。

g）对于Calbryte 520 AM，在Ex / Em = 490 / 525nm处进行钙测试，对于Calbryte 590 AM，使用540/590nm进行钙测试，对于Calbryte 630 AM，使用610/640nm进行钙测试。

2.测量细胞内钙响应：

图1. CHO-K1细胞中内源性P2Y受体对ATP的反应。 将CHO-K1细胞以每孔100μL每孔40,000个细胞接种过夜，在96孔黑色壁/透明底板中。 将含有丙磺舒的HHBS中的100μLFluo-4AM或Calbryte TM 520AM加入孔中，并将细胞在37℃下孵育45分钟。 用200μLHHBS替换染料加载培养基，加入50μL50μMATP，并使用FITC通道用荧光显微镜（Keyence）成像。

图2.用Calbryte 520或Fluo-4 AM测量的CHO-M1细胞中外源M1受体的卡巴胆碱刺激的钙响应。 在96孔黑壁/透明底板中，将CHO-M1细胞以每100μL/孔40,000个细胞接种过夜。 将100μLFluo-4AM或不含丙磺舒的Calbryte 520AM加入细胞中，并将细胞在37℃下孵育45分钟。 通过FlexStation 3（Molecular Devices）添加Carbachol（50μL/孔）以达到终指示的浓度。

图3. CHO-K细胞中内源性P2Y受体对ATP的反应。 在96孔黑壁/透明底板中，将CHO-K细胞以每100μL/孔40,000个细胞接种过夜。 将100μL具有2mM丙磺舒的HbBS中的Calbryte 590AM或Calbryte  630 AM加入孔中，并将细胞在37℃下孵育1小时。 将染料加载培养基替换为200μLHHBS，用50μL50μMATP处理，并使用TRITC通道（Calbryte  590）和Texas Red Channel（Calbryte 630）用荧光显微镜（Keyence）成像。

结论

        由于Ca ²⁺在生物学中的重要性，已经建立了许多用于分析细胞和/或亚细胞Ca ²⁺活性机制的技术/方法。 尽管用于分析Ca ²⁺活性的每种方法都具有优于其他方法的某些优点，但每种方法也存在缺点。 凭借上述出色的性能，我们相信Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630钙检测试剂为各种生物系统中的细胞内钙分析和监测提供了新的强大工具。

        正如可能预测的那样，Ca^{2 +}分析中许多研究人员的兴趣从细胞水平转移到亚细胞水平。 已经发现Ca^{2 +}在整个细胞中均匀分布，并且在多种细胞（例如，卵母细胞，心肌细胞，肝细胞和外分泌细胞）中观察到Ca^{2 +}的细胞内异质性（例如Ca²⁺ waves and Ca²⁺ sparks）。 随着20世纪80年代共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和2000年代先进的酶标仪（如FLIPR，FDSS和NOVOStar专用于细胞内Ca^{2 +}检测）的出现，细胞内Ca^{2 +}的测量显着加速。 共聚焦激光扫描显微镜和近的多光子显微镜除了测量其浓度外，还允许在亚细胞水平上对细胞内Ca ²⁺信号传导进行的空间和时间分析。

参考文献

Behavioral role of the reciprocal inhibition between a pair of Mauthner cells during fast escapes in zebrafish
Authors: Takashi Shimazaki, Masashi Tanimoto, Yoichi Oda, Shin-ichi Higashijima
Journal: Journal of Neuroscience (2019): 1182–1194

Deep Two-Photon Imaging In Vivo with a Red-Shifted Calcium Indicator
Authors: Antje Birkner, Arthur Konnerth
Journal: (2019): 15–26

In Vivo Functional Mapping of a Cortical Column at Single-Neuron Resolution
Authors: Carsten H Tischbirek, Takahiro Noda, Manabu Tohmi, Antje Birkner, Israel Nelken, Arthur Konnerth
Journal: Cell reports (2019): 1319–1326

Multiplex imaging of quantal glutamate release and presynaptic Ca2+ at multiple synapses in situ
Authors: Thomas P Jensen, Kaiyu Zheng, Nicholas Cole, Jonathan S Marvin, Loren L Looger, Dmitri A Rusakov
Journal: bioRxiv (2019): 336891

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Journal: Nature Communications (2019): 1414

A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer’s disease
Authors: Joseph Park, Isaac Wetzel, Ian Marriott, Didier Dréau, Carla D’Avanzo, Doo Yeon Kim, Rudolph E Tanzi, Hansang Cho
Journal: Nature neuroscience (2018): 941

Concepts of All-Optical Physiology
Authors: Jan Doering, Ting Fu, Isabelle Arnoux, Albrecht Stroh
Journal: (2018): 153–174

Optical probes for neurobiological sensing and imaging
Authors: Eric H Kim, Gregory Chin, Guoxin Rong, Kira E Poskanzer, Heather A Clark
Journal: Accounts of chemical research (2018): 1023–1032

Optogenetic Control of Voltage-Gated Calcium Channels
Authors: Guolin Ma, Jindou Liu, Yuepeng Ke, Xin Liu, Minyong Li, Fen Wang, Gang Han, Yun Huang, Youjun Wang, Yubin Zhou
Journal: Angewandte Chemie International Edition (2018): 7019–7022

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Authors: Raúl Lagos-Cabré, Alvaro Alvarez, Milene Kong, Francesca Burgos-Bravo, Areli Cárdenas, Edgardo Rojas-Mancilla, Ramón Pérez-Nunez, Rodrigo Herrera-Molina, Fabiola Rojas, Pascal Schneider
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除了方便的激发波长和钙的大荧光增强外，Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630主要定位于细胞溶胶中，不像Rhod-2主要位于线粒体中。 此外，Calbryte 590和Calbryte 630的长Ex / Em波长使这些染料成为钙指示剂，可与绿色荧光蛋白（GFP）细胞系进行多色检测。 此外，Calbryte 520，Calbryte 590或Calbryte 630钙测定经过优化，可与大多数现有荧光仪器兼容。 Calbryte 520可在488 nm处激发，并与FITC滤光片组配合使用。 Calbryte 590经过优化，可在555 nm激发，并与TRITC / Cy3滤光片组配合使用。 Calbryte 630经过优化，可在594 nm激发，并与TexasRed®滤光片组配合使用。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的钙离子荧光探针。

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钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

使用Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM酯类

1.操作步骤

        Calbryte AM酯应在使用前在无水DMSO中重新配制。 DMSO储备溶液可以在-20℃下储存（干燥）并避光。 在这些条件下，AM酯应稳定三个月。 以下是我们推荐的将Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM酯加入活细胞的方案。 该方案仅提供指南，实际应根据您的特定需求进行修改。

a）在无水DMSO中制备2至5mM Calbryte 520AM，Calbryte 590AM或Calbryte 630AM酯的储备溶液。

b）将Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。 在Hanks和Hepes缓冲液（HHBS）或您选择的缓冲液（0.04％Pluronic®F-127）中制备10至20μM的染料工作溶液。 细胞加载所需指示剂的确切浓度必须根据经验确定。

注意：非离子型洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM酯的水溶性。 各种Pluronic®F-127可从金畔购买。

c）如果您的细胞（如CHO细胞）含有有机阴离子转运蛋白，可将丙磺舒（1-2 mM）添加到染料工作溶液中（终浓度为0.5-1 mM）

注意：各种ReadiUse 丙磺舒（包括水溶性钠盐和稳定溶液）均可从金畔购买。

d）将等体积的染料工作溶液（来自步骤b或c）加入细胞板中。

e）将染料加载板在细胞培养箱中孵育约60分钟，然后将板在室温下再孵育15分钟。

f）用HHBS或您选择的含有阴离子转运蛋白抑制剂（如1 mM丙磺舒）的缓冲液替换染料工作溶液，以去除多余的探针。

g）对于Calbryte 520 AM，在Ex / Em = 490 / 525nm处进行钙测试，对于Calbryte 590 AM，使用540/590nm进行钙测试，对于Calbryte 630 AM，使用610/640nm进行钙测试。

2.测量细胞内钙响应

图1. CHO-K1细胞中内源性P2Y受体对ATP的反应。 将CHO-K1细胞以每孔100μL每孔40,000个细胞接种过夜，在96孔黑色壁/透明底板中。 将含有丙磺舒的HHBS中的100μLFluo-4AM或Calbryte 520AM加入孔中，并将细胞在37℃下孵育45分钟。 用200μLHHBS替换染料加载培养基，加入50μL50μMATP，并使用FITC通道用荧光显微镜（Keyence）成像。

图2.用Calbryte 520或Fluo-4 AM测量的CHO-M1细胞中外源M1受体的卡巴胆碱刺激的钙响应。 在96孔黑壁/透明底板中，将CHO-M1细胞以每100μL/孔40,000个细胞接种过夜。 将100μLFluo-4AM或不含丙磺舒的Calbryte 520AM加入细胞中，并将细胞在37℃下孵育45分钟。 通过FlexStation 3（Molecular Devices）添加Carbachol（50μL/孔）以达到终指示的浓度。

图3. CHO-K细胞中内源性P2Y受体对ATP的反应。 在96孔黑壁/透明底板中，将CHO-K细胞以每100μL/孔40,000个细胞接种过夜。 将100μL具有2mM丙磺舒的HbBS中的Calbryte 590AM或Calbryte  630 AM加入孔中，并将细胞在37℃下孵育1小时。 将染料加载培养基替换为200μLHHBS，用50μL50μMATP处理，并使用TRITC通道（Calbryte  590）和Texas Red Channel（Calbryte 630）用荧光显微镜（Keyence）成像。

结论

        由于Ca ²⁺在生物学中的重要性，已经建立了许多用于分析细胞和/或亚细胞Ca ²⁺活性机制的技术/方法。 尽管用于分析Ca ²⁺活性的每种方法都具有优于其他方法的某些优点，但每种方法也存在缺点。 凭借上述出色的性能，我们相信Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630钙检测试剂为各种生物系统中的细胞内钙分析和监测提供了新的强大工具。

        正如可能预测的那样，Ca^{2 +}分析中许多研究人员的兴趣从细胞水平转移到亚细胞水平。 已经发现Ca^{2 +}在整个细胞中均匀分布，并且在多种细胞（例如，卵母细胞，心肌细胞，肝细胞和外分泌细胞）中观察到Ca^{2 +}的细胞内异质性（例如Ca²⁺ waves and Ca²⁺ sparks）。 随着20世纪80年代共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和2000年代先进的酶标仪（如FLIPR，FDSS和NOVOStar专用于细胞内Ca^{2 +}检测）的出现，细胞内Ca^{2 +}的测量显着加速。 共聚焦激光扫描显微镜和近的多光子显微镜除了测量其浓度外，还允许在亚细胞水平上对细胞内Ca ²⁺信号传导进行的空间和时间分析。

参考文献

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钙离子荧光探针Cal-520 , AM是美国AAT Bioquest生产的钙离子荧光探针，钙在各种细胞中充当通用的第二信使。 生命的开始，受精行为，受Ca²⁺调节。 所有类型细胞的许多功能都被Ca²⁺或多或少地调节。 自20世纪20年代以来，科学家们一直试图测量Ca²⁺，但由于Ca²⁺探针的有限性，很少有人成功。 Ridgway和Ashley通过将发光蛋白水母发光蛋白注射到藤壶的巨大肌纤维中来进行Ca²⁺的首次可靠测量。 随后，在20世纪80年代，Tsien及其同事制作了各种荧光指示剂。 其中，基于荧光素的Ca²⁺试剂（如Fluo-3和Fluo-4）为测量Ca²⁺提供了值得信赖的方法。 自从这些Ca²⁺探针发展以来，对Ca²⁺相关的细胞内现象的研究已经飙升。

自从Fluo-3推出以来，Fluo-3成像及其类似物（如Fluo-4）揭示了Ca²⁺信号传导中许多基本过程的空间动力学。 Fluo-3和Fluo-4也已广泛用于流式细胞术和基于微孔板（如FLIPR）的钙检测。然而，对于染料提取物的弱信号和高剂量的丙磺舒需要限制了它们在一些细胞分析中的应用，特别是对于那些对丙磺舒敏感的GPCR和钙通道细胞系。我们开发了无色Cal-520系列钙检测试剂，以解决Fluo-3和Fluo-4的这些局限性。

Fluo-3和Fluo-4在细胞应用中最重要的特性是它们的吸收光谱与氩离子激光源在488nm激发相容，并且响应Ca2 +结合的荧光强度增加非常大。使用我们的Cal-520 Ca²⁺检测试剂保留了这两个有价值的特性。 Cal-520试剂的吸收和发射峰分别为490nm和514nm。它们可以用488nm的氩离子激光很好地激发，并且它们发射的荧光（波长514nm）随着Ca²⁺的增加而增加。确定Cal-520在与Ca²⁺结合后经历> 200倍的荧光增加。由于刺激后许多细胞中Ca²⁺的增加范围通常为5至10倍，因此Cal-520是在该区域中以高灵敏度使用的优异探针。 Cal-520的Kd估计为380nM（22℃，pH 7.0-7.5），但该值可能受pH，粘度和体内条件下结合蛋白的显着影响。

除了方便的488 nm激发波长和钙的大荧光增强外，与包括Fluo-3和Fluo-4在内的所有其他现有荧光钙指示剂相比，Cal-520具有更好的信号背景（S / B）比。此外，Cal-520对位于细胞膜中的有机阴离子转运蛋白具有更强的抵抗力，因此具有比Fluo-3和Flu-4更好的细胞保留特性。这一特性使Cal-520更适合HTS应用。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的钙离子荧光探针。

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钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

将Cal-520®，AM加载到活细胞中的方案

操作步骤

1.准备HHBS缓冲液，10％Pluronic®F-127溶液和25 mM 丙磺舒溶液

2.在高质量无水DMSO中制备2 mM至5 mM Cal-520®，AM原液
a.Cal-520®，AM的用量：1毫克
b.所需浓度：2 mM
c.在合适的容器中，将1mg的Cal-520，AM与453.33μL的无水DMSO混合。

3.使用10μMCal-520®，AM 4在HHBS中制备2X工作溶液，0.08％Pluronic®F-127和2 mM丙磺舒。
a.最终孔内浓度为Cal-520®，AM：5μM
b.Pluronic®F-127的最终井内浓度：0.04％
c.最终孔内浓度的丙磺舒：1mM
d.在合适的容器中混合16μL的Cal-520，AM，25.6μL的10％Pluronic F-127和256μL的25mM丙磺舒。然后，添加HHBS或您选择的缓冲液，直到体积为3.2 mL。

注意：对于大多数细胞系，我们建议使用Cal-520®的最终浓度，AM为4至5μM。
注意：推荐的Pluronic F-127井浓度最终为0.02％至0.04％。
注意：推荐的最终浓度为1至2.5 mM的丙磺舒。

4.将100μL染料工作溶液加入已经含有100μL培养基的所需孔中。
a.该步骤将染料工作溶液从2X稀释至1X，并将每种组分的最终浓度调节至：5μMCal-520®，AM，0.04％Pluronic®F-127,1mM丙磺舒。

5.孵育
a.将添加染料的培养基在细胞培养箱中孵育60-90分钟。
b.将添加染料的培养基在室温下孵育30分钟。

6.用1.0 mM 丙磺舒，准备HHBS缓冲液（或您选择的缓冲液）
a.在合适的容器中加入160μL的25mM丙磺舒。 接下来，添加HHBS或您选择的缓冲液，直到体积为4 mL

7.用HHBS缓冲液或您选择的缓冲液替换染料工作溶液，使用1.0 mM 丙磺舒。
a.首先，从所需孔中除去200μL染料工作溶液和培养基。
b.在相同的孔中加入200μL含有1.0mM丙磺舒的HHBS（或您选择的缓冲液）。

8.实验观察
a.为您的样品添加所需的处理。
b.在Ex / Em = 492/514 nm进行观察。

附加信息

1 M NaOH配方：
1.在合适的容器中准备2 mL蒸馏水。
2.在混合下向溶液中缓慢加入100mg NaOH。
3.加入蒸馏水至体积为2.5 mL。
4.在室温下将溶液储存在塑料容器中。

注意：步骤2这是一个放热过程，应遵循适当的预防措施和指南。

10％Pluronic F-127配方：
1.将1克Pluronic®F-127（Cat#20050）溶解在10毫升蒸馏水中，制成10％（w / v）储备溶液。
2.在40至50℃的温度下加热10％Pluronic F-127储备溶液约30分钟。
3.根据其储存规格储存多余的10％Pluronic®F-127。

25 mM Probenecid配方：
1.在合适的容器中，将1小瓶（72mg）的丙磺舒（Cat＃20060）溶解在0.3mL的1M NaOH中。
2.加入HHBS或您选择的缓冲液，直至体积为10 mL。
3.根据其储存规格分装并储存任何未使用的25 mM 丙磺舒溶液。

重点提示：
1.可根据实验设置的需要和体积调整浓度。
2.Pluronic®F-127（PF-127）是一种非离子表面活性剂，对细胞无毒。 PF-127通常与染料一起使用AM酯改善其水溶性。
3.如果您的细胞含有有机体阴离子转运蛋白，可将丙磺舒（0.5-1.0 mM）添加到染料工作溶液中减少脱酯化指标的泄漏。
4.细胞加载所需指示剂的确切浓度必须根据经验确定。
5.如果孵育> 2小时，染料在一些细胞系上表现更好。

参考文献

In Neurobiology, Cal-520® AM has been used to study:
» Neuron single action potentials in neocortical neurons both in vitro and in vivo, and associated voltage-dependent calcium channels^[1]
» Superior colliculus in mice in conjunction with two-photon calcium imaging to visualize retinal ganglion cells in the superficial lamina^[2]
» Aldolase C compartments in mice, looking at complex spike synchrony and its relation to sensory processing in awake animals^[3]
» Neural circuits in brain slice and whole brain preparation, specifically looking at individual action potentials in vivo^[4]
» Ca2+ dependent cell signaling pathways using cultured human neuroblastoma SH-SY5Y cells and high-speed video-microscopy^[5]

In Cell Signaling, Cal-520® AM has been used to study:
» Intracellular calcium in sperm using the microplate reader platform as a means to quantitating parameters such as motility^[6]
» Calcium signaling pathways in meniscus fibrochondrocytes by way of visualizing calcium localization and concentration^[7]
» Ca2+ mediated cellular signaling in relation to inositol triphosphate and its flux through gap junctions^[8]
» Retinal wave-mediated formation of calcium transients in Müller glial cells with focus on expression of GCaMP3^[9]
» Ca2+ signaling pathways in zebrafish sperm, specifically looking at calcium flux resulting from cGMP-induced hyperpolarization^[10]

In Cardiology, Cal-520® AM has been used to study:
» Sarcoplasmic reticulum insofar as its role in cardiac excitation-contraction coupling and calcium spark events^[11]
» Optical mapping of calcium in cardiac tissue slices to develop a framework for future investigations into calcium transients^[12]
» Sodium-calcium exchanger functionality and mechanism with regards to burst pacemaker activity in knockout mice^[13]
» Pacemaker modulation in embryonic heart as a function of inositol-1,4,5-triphosphate receptors^[14]
» Calcium current and the role of potassium channel-interacting protein 2 (KChIP2) in mice with regards to heart failure^[15]

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