样品实验方案
简要概述
1.用测试化合物制备细胞
2.加入相同体积的CytoCalcein Green / Propidium Iodide染料加工溶液(100μL/孔/ 96孔板或25μL/孔/ 384孔板)
3.在室温或37°C孵育1小时
4.在强度下监测荧光(底部读取模式)Ex / Em = 490 / 525nm(截止= 515nm)和540 / 620nm(截止= 590nm),带有FITC滤光片(细胞存活)的荧光显微镜和TRITC滤光片 (细胞死亡),或FL1和FL2通道的流式细胞仪。
溶液配制
1.储存溶液配制
除非另有说明,否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样,并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
CytoCalcein 绿色原液:
将20μLDMSO(组分C)加入到CytoCalcein Green(组分A)的小瓶中并充分混合以制备CytoCalcein Green原液。 避光。 注意:20μL的CytoCalcein Green原液足以用于一个平板。 存放时,密封管。
2.工作溶液配制
将全部内容物(20μL)的CytoCalcein Green储备溶液和20μL碘化丙啶(组分B)加入10mL测定缓冲液(组分C)中并充分混合以制备CytoCalcein Green /碘化丙锭染料 – 工作溶液。 CytoCalcein Green / Propidium Iodide染料加工溶液在室温下稳定至少2小时。 注意:如果CHO细胞等细胞含有导致荧光染料随时间泄漏的有机阴离子转运蛋白,应制备丙磺舒储备溶液,并加入到加样缓冲液中,终孔内工作浓度范围为1到2.5 mM。 未使用的丙磺舒储备溶液可以在≤-20℃下储存。 由于佳染色条件可能因细胞类型的不同而异,因此建议单独确定组分A和B的适当浓度。有关细胞样品制备的指南,请点击查看。
操作步骤
1.用酶标仪或荧光显微镜进行细胞活力测定:
1.1根据需要用测试化合物处理细胞。注意:在添加化合物之前不必洗涤细胞。然而,如果测试的化合物对血清敏感,则可在添加化合物之前吸出生长培养基和血清因子。在抽吸后加入100μL/孔/ 96孔板和25μL/孔/ 384孔板的1X Hank盐溶液和20mM Hepes缓冲液(HHBS)或您选择的缓冲液。或者,细胞可以在无血清培养基中生长。
1.2加入100μL/孔(96孔板)或25μL/孔(384孔板)的CytoCalcein TM Green / Propidium Iodide染料加工溶液。
1.3将板在室温或37°C孵育30分钟至1小时,避光。 (孵育时间可以从15分钟到过夜。我们得到了佳结果,孵育时间少于4小时)。注意:适当的孵育时间取决于所使用的单个细胞类型和细胞浓度。优化每个实验的孵育时间。装载后请勿清洗细胞。对于非粘附细胞,建议在孵育后以800rpm离心细胞板2分钟,然后关闭制动器。
1.4使用荧光酶标仪(底部读取模式)在Ex / Em = 490 / 525nm(截止= 515nm)和Ex / Em = 540 / 620nm(截止= 590nm,细胞死亡)或荧光下监测荧光强度用于活细胞的FITC过滤器或用于死细胞的TRITC过滤器的显微镜。
2.使用流式细胞仪进行细胞活力测定:
2.1用测试化合物处理细胞一段所需的时间。
2.1离心细胞,得到1-5×105个细胞/管。
2.3将细胞重悬于500μL的CytoCalcein™Green / Propidium Iodide染料加工溶液中。
2.4在室温或37°C孵育10至30分钟,避光。
可选:用HHBS或您选择的缓冲液清洗细胞。 将细胞重悬于500μLHHBS中,每管加入1-5×105个细胞。
2.5用流式细胞仪在Ex / Em = 490 / 525nm和Ex / Em = 490 / 620nm(FL1和FL2通道)下监测荧光强度。
数据分析
图1.使用Cell Meter Cell Viability Assay Kit测量Jurkat细胞对皂苷诱导的细胞死亡的影响。 用或不用0.5%皂苷处理2×10 6个细胞/ mL的Jurkat细胞5分钟。 离心细胞,用新鲜培养基替换上清液。 将100uL未处理的细胞(A),各50μL未处理和处理的细胞(B),25uL未处理的和75uL处理的细胞(C)和100uL的0.5%皂苷处理的细胞(D)接种在 96孔黑色墙壁/透明底部聚-D-赖氨酸板。 将细胞与100μL/孔的CytoCalcein Green / Propidium Iodide染料 – 工作溶液在37℃下孵育1小时。 使用NOVOstar仪器(BMG Labtech)在底部读取模式下在Ex / Em = 490 / 525nm和540 / 650nm下测量荧光强度。 如所示(n = 6)显示活细胞和死细胞上490 / 525nm与540 / 650nm荧光强度的比率。 |
参考文献
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