Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒（比色法）是AAT Bioquest研发的检测NADP+/NADPH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是细胞中发现的两种重要的辅因子。NADH是NAD +的还原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。NADP用于合成代谢生物反应，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作为还原剂。在叶绿体中，NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来完成。该方法具有低灵敏度和高干扰，因为该测定在需要昂贵的石英微孔板的UV范围内进行。

Amplite™比色总NADP和NADPH检测试剂盒为敏感检测NADP和NADPH提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NADP / NADPH，其显着提高了检测灵敏度。 此外，该测定具有非常低的背景，因为其在较长波长范围内运行，这显著降低了来自生物样品的干扰。 该实验证明了高灵敏度和低干扰。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒。

Amplite™比色总NADP和NADPH分析试剂盒提供灵敏的一步法分析，可在100μL分析体积（100 nM）内检测少至10皮摩尔的NADP（H）。 该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且容易适应自动化而无需分离步骤。 其信号可通过吸光度酶标仪在~575nm或~570nm至~605nm的吸光度比下轻松读取，以提高测定灵敏度。 如果需要更高的灵敏度，建议使用Cat#15259或15264。

适用仪器

96孔板测定示例

概述

准备NADP / NADPH反应混合物（50μL）

加入NADPH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟–2小时

监测575±5nm处的吸光度强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

操作方法

1.准备NADPH原液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADPH储备溶液。

注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.制备NADP / NADPH反应混合物：

将10mL NADP / NADPH传感器缓冲液（组分B）加入NADP / NADPH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：这种NADP / NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NADP / NADPH混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至10μM）：

3.1将10μLNADPH储备溶液（来自步骤1）加入990L PBS缓冲液中以产生10M（10pmol / L）NADPH标准溶液。

注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL10μMNADPH标准溶液进行1：3连续稀释，得到NADPH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01,0.003和0μM连续稀释液。

3.3如表1和表2所述，将NADPH标准品和含有NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

表1在白色/透明底96孔微孔板中的NADPH标准品和测试样品的布局

注意：NS = NADPH标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成

注意：将连续稀释的NADPH标准品从0.003μM至3μM加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADPH（例如，>100μM，终浓度）可能由于NADPH传感器的过度氧化而导致信号降低。

4.在上清液中运行NADP / NADPH测定：

4.1将50μLNADPH反应混合物（来自步骤2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADPH测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用吸光度读数仪在575±5 nm或~570 nm至~605 nm的吸光度比下观察吸光度的增加，以提高检测灵敏度。

注意1：对于NADP / NADPH比率测量，建议使用试剂盒15263。

注意2：对于基于细胞的NADP / NADPH测量，建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（Cat#20012）裂解细胞。

数据分析

        空白孔中的吸光度（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从NADPH反应孔的值中减去。 NADPH标准曲线如图1所示。

        注意：吸光度背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的吸光度非常重要。

图1.使用NOVOStar酶标仪（BMG Labtech），在白色/透明底96孔板中用Amplite™比色总NADP和NADPH测定试剂盒测量NADPH剂量反应。 在孵育1小时（n = 3）时可以检测到低至100nM（10pmol /孔）的NADPH，而NADH没有响应。

参考文献

Comparative transcriptome analysis of a long-time span two-step culture process reveals a potential mechanism for astaxanthin and biomass hyper-accumulation in Haematococcus pluvialis JNU35
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该Amplite 比色NADP / NADPH比率分析试剂盒提供了一种比色法，用于测量培养细胞中细胞内总NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。 在该测定中，裂解物中的NADPH可以用NADPH提取溶液提取，然后通过NADPH探针识别，在反应后得到黄色染料，其在460nm处具有吸光度。 产生的染料量与细胞裂解物中NADP或NADPH的浓度成正比，可用作细胞NADP / NADPH浓度的指示剂。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的NADP/NADPH检测试剂盒。 

96孔板检测示例

概述

准备25μLNADPH标准品和/或测试样品

加入25μLNADPH提取液

在室温下孵育15分钟

加入25μL中和溶液

加入75μLNADPP/ NADPH反应混合物在室温下孵育15分钟至2小时监测 在460nm处的吸光度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

操作步骤

1.准备NADPH原液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADPH储备溶液。

注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.制备NADP / NADPH反应混合物：

2.1将8mL NADPH探针缓冲液（组分B-II）加入到NADP / NADPH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

2.2将2 mL NADPH探针（组分B-I）加入上述瓶中（来自步骤2.1）并充分混合。

注意：这种NADP / NADPH反应混合物足以进行125~200次分析。 未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

3.准备连续稀释的NADPH标准品（0至2μM）：

3.1将2L 1mM NADPH储备溶液（来自步骤1）加入998L PBS缓冲液（pH7.4）中，产生2M（2 pmols / L）NADPH标准溶液。

注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL2MNADPH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：2连续稀释，得到1，0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0M系列稀释的NADPH标准品。

4.运行总NADP / NADPH分析（总共400个分析/试剂盒）：

4.1如说明书中的表1和2中所述，将NADPH标准品和含有NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞。 （详见附录）。

4.2将50μL的NADP / NADPH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤4.1）的每个孔中，以使总NADP / NADPH测定体积为100μL/孔。

4.3在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.4使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

5.运行NADP / NADPH比率分析（总共250个分析/试剂盒）：

5.1如说明书中的表3和4中所述，将连续稀释的NADPH标准品和/或含NADP / NADPH的测试样品加入白色/透明96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞。

5.2对于NADPH提取（NADPH量）：将25μLNADPH提取溶液（组分D）加入含有NADP / NADPH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μL中和溶液（组分E）以中和NADPH提取物，如说明书中的表3和4中所述。

对于总NADP和NADPH（总量）：将25μLNADPP/ NADPH对照溶液（组分F）加入NADPH标准品的孔和含有NADP / NADPH的测试样品中。在室温下孵育10至15分钟，然后如说明书中的表3和4中所述添加25μL提取对照溶液（组分F）。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。为方便起见，裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞（详见附录）。

5.3将75μL的NADP / NADPH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品（NADP / NADPH）的每个孔中，并测试样品（NADPH提取物）（来自步骤5.1）以使总量达到测定体积为150μL/孔。

5.4在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

5.5使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

数据分析

        空白孔中的吸光度（仅PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。

图1. Amplite™比色NADP / NADPH比率分析试剂盒用于使用SpectraMax酶标仪（Molecular devices）测量白色/透明96孔微量培养板中的总NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。

A-总NADPH和NADP剂量反应：孵育1小时可检测到低至0.03μM的总NADPH。

B-NADP / NADPH比例：用或不用NADP提取溶液处理等量的NADP和NADPH混合物15分钟，然后在室温下用提取溶液中和。 在460nm读取信号。 NADP / NADPH摩尔比基于图1B中所示的吸光度计算。

附录：使用组分G（NAD / NADH裂解缓冲液）的测试样品制剂

1.植物细胞样品：

用裂解缓冲液以200mg / mL均化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。

2.样品：

离心收集细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟。以2500 rpm离心5分钟， 用上清液进行试验。

3.哺乳动物细胞样本：

从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液在室温下保持15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。

4.组织样品：

称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。

试剂应用文献

Impact of Genetic Reduction of NMNAT2 on Chemotherapy-Induced Losses in Cell Viability In Vitro and Peripheral Neuropathy In Vivo
Authors: Slivicki, Richard A and Ali, Yousuf O and Lu, Hui-Chen and Hohmann, Andrea G
Journal: PloS one (2016): e0147620

NMNAT2: HSP90 Complex Mediates Proteostasis in Proteinopathies
Authors: Ali, Yousuf O and Allen, Hunter M and Yu, Lei and Li-Kroeger, David and Bakhshizadehmahmoudi, Dena and Hatcher, Asante and McCabe, Cristin and Xu, Jishu and Bjorklund, Nicole and Taglialatela, Giulio and others
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Journal: PLoS Genet (2015): e1005599

Analysis of the nicotinamide phosphoribosyltransferase family provides insight into vertebrate adaptation to different oxygen levels during the water-to-land transition
Authors: Fang, Chengchi and Guan, Lihong and Zhong, Zaixuan and Gan, Xiaoni and He, Shunping
Journal: FEBS journal (2015): 2858–2878

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Journal: Metabolomics (2015): 603–619

参考文献

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Authors: Weiwei Zhang, Huimin Huang, Haibo Cai, Wen-Song Tan
Journal: Cell proliferation (2019)

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96孔板检测示例

概述

准备NADP / NADPH反应混合物（50μL）

加入NADPH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟至2小时

监测460nm处的吸光度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

操作步骤

1.准备NADPH原液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADPH储备溶液。

注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.制备NADP / NADPH反应混合物：

2.1将8mL NADPH探针缓冲液（组分B-II）加入到NADP / NADPH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

2.2将2 mL NADPH探针（组分B-I）加入上述瓶中（来自步骤2.1）并充分混合。

注意：这种NADP / NADPH反应混合物足以进行200次分析。未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至2μM）：

3.1将2L 1mM NADPH储备溶液（来自步骤1）加入998L PBS缓冲液（pH7.4）中，产生2M（2 pmols / L）NADPH标准溶液。

注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL2MNADPH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：2连续稀释，得到1，0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0M系列稀释的NADPH标准品。

3.3如表1和2中所述，将含有NADPH标准品和含NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞。 （详见附录）。 

表1：白色/透明底96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局

注意：NS = NADPH标准，BL =空白对照，TS =测试样品

表2：每个孔的试剂组成

*注意：将连续稀释的NADPH标准品（0.0313μM至2μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADPH（例如，>30μM，终浓度）将导致饱和信号并使校准曲线非线性。

4.在上清液反应中运行NADPH测定：

4.1将50μL的NADP / NADPH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADP / NADPH测定体积为100μL/孔

注意1：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADP/ NADPH反应混合物。

注意2：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞。 （详见附录）。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

数据分析

        空白孔中的吸光度（仅PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。

图1 使用SpectraMax酶标仪（Molecular devices），在96孔白色/透明底板中用Amplite ™比色总NADP和NADPH测定试剂盒*增强灵敏度*测量NADPH剂量反应。孵育1小时（n = 3）可以检测到低至0.03μM的NADPH，在460nm处测量吸光度。

附录：使用组分G（NAD / NADH裂解缓冲液）的测试样品制剂

1.植物细胞样品：用200mg / mL的裂解缓冲液均质化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。

2.细胞样品：离心收集细胞（（10,000 g，℃，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟.2500℃离心 转速5分钟，并用上清液进行试验。

3.哺乳动物细胞样品：从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液保持在室温下 15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。

4.组织样品：称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。

参考文献

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Authors: Kazuhiro Saihara, Ryosuke Kamikubo, Kazuto Ikemoto, Koji Uchida, Mitsugu Akagawa
Journal: Biochemistry (2017)

Resveratrol attenuates excessive ethanol exposure induced insulin resistance in rats via improving NAD+/NADH ratio
Authors: Gang Luo, Bingqing Huang, Xiang Qiu, Lin Xiao, Ning Wang, Qin Gao, Wei Yang, Liping Hao
Journal: Molecular Nutrition & Food Research (2017)

A Snapshot of the Plant Glycated Proteome STRUCTURAL, FUNCTIONAL, AND MECHANISTIC ASPECTS
Authors: Tatiana Bilova, Elena Lukasheva, Dominic Brauch, Uta Greifenhagen, Gagan Paudel, Elena Tarakhovskaya, Nadezhda Frolova, Juliane Mittasch, Gerd Ulrich Balcke, Alain Tissier
Journal: Journal of Biological Chemistry (2016): 7621–7636

AMPK activation protects cells from oxidative stress-induced senescence via autophagic flux restoration and intracellular NAD+ elevation
Authors: Xiaojuan Han, Haoran Tai, Xiaobo Wang, Zhe Wang, Jiao Zhou, Xiawei Wei, Yi Ding, Hui Gong, Chunfen Mo, Jie Zhang
Journal: Aging cell (2016): 416–427

Cell-Line Selectivity Improves the Predictive Power of Pharmacogenomic Analyses and Helps Identify NADPH as Biomarker for Ferroptosis Sensitivity
Authors: Kenichi Shimada, Miki Hayano, Nen C Pagano, Brent R Stockwell
Journal: Cell chemical biology (2016): 225–235

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