PhosphoWorks 荧光法焦磷酸检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测焦磷酸的试剂盒，焦磷酸盐（PPi）通过许多生化反应产生，例如ATP水解，DNA和RNA聚合，腺苷酸环化酶形成的环AMP和脂肪酸的酶促活化以形成它们的辅酶A酯。我们的PhosphoWroks 焦磷酸盐检测试剂盒提供了强大的分光光度法测量焦磷酸盐。该试剂盒使用我们专有的荧光焦磷酸盐，其荧光强度成比例地取决于焦磷酸盐的浓度。与磷酸盐和ATP相比，该试剂盒中使用的PPi探针对PPi具有相当高的选择性。我们的测定法比酶偶联焦磷酸盐方法更容易和更稳定，这些方法需要至少两种酶用于焦磷酸盐检测。该试剂盒提供了测定焦磷酸盐的所有必需成分。该试剂盒已成功用于高通量筛选（HTS）。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的PhosphoWorks 荧光法焦磷酸检测试剂盒。 

操作步骤

简要概述

准备PPi探针工作溶液（50μL）
添加焦磷酸盐标准品和/或测试样品（50μL）
在室温下孵育10至30分钟
检测Ex / Em = 370/470 nm处的荧光强度（cutoff= 455 nm）

溶液制备

1.制备储备溶液

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1.1 PPi探针储备溶液（200X）：
将50μLDMSO（组分D）加入到PPi探针（组分B）的小瓶中以制备200X PPi探针储备溶液。 注意：对于一个96孔板，25μLPPiSensor储备溶液就足够了。

2.制备标准溶液

焦磷酸盐标准
通过将10μL50mM焦磷酸盐标准品（组分C）加入490μL测定缓冲液（组分A）或您选择的缓冲液（优选50 mM Hepes缓冲液，pH 7）中制备1 mM焦磷酸盐标准品，制成1 mM焦磷酸盐标准品。 取1 mM焦磷酸盐标准品（PS7）进行1：3连续稀释，得到连续稀释的焦磷酸盐标准品（PS6-PS1）和测定缓冲液（组分A）。

3.制备工作溶液

将25μL200XPPi Sensor储备溶液加入5 mL分析缓冲液（组分A）中，并充分混合。 注意：由于该检测方法对PPi具有高灵敏度，因此使用不含PPi的实验室器具和试剂非常重要。 注意：DTT（1 uM）会增加背景，MgCl2≥2mM会降低反应。

样品实验方案

表1.实心黑色96孔微孔板中焦磷酸盐标准品和测试样品的布局。

PS =焦磷酸盐标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成

根据表1和2中提供的布局制备焦磷酸盐标准品（PS），空白对照品（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25μL试剂代替50μL。

向焦磷酸盐标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50μLPPiSensor工作溶液，使总测定体积为100μL/孔。 对于384孔板，在每个孔中加入25μLPPiSensor工作溶液，总体积为50μL/孔。

在室温下孵育反应10-30分钟，避光。

使用荧光酶标仪在Ex / Em = 370/470 nm（截止= 455 nm）下检测荧光

数据分析

        从空白标准孔获得的读数（RFU）用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。 然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。 该等式可用于计算PPi样本。 我们建议使用在线线性回归计算器，该计算器可在以下位置找到：

图1.使用PhosphoWorks Fluoremetric焦磷酸盐测定试剂盒在固体黑色96孔板中使用荧光酶标仪测量焦磷酸盐，ATP和磷酸盐剂量响应。

参考文献

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