PROTAC的发展概述

临床上使用的大多数药物都是基于小分子的。与传统的小分子抑制剂和拮抗剂不同，蛋白质降解技术由于能够诱导治疗靶点蛋白质的降解，近年来发展迅速，为新药的开发提供了新的思路。

PROTACs（PROteothesis-Targeting Chimeras）的概念最早由Crews等人提出。 2001年，PROTACs可以利用体内天然的蛋白质清洁系统来降低蛋白质水平而不是抑制蛋白质功能，从而治愈疾病。 PROTAC是一种异双功能分子，看起来像哑铃，分子的一端连接到结合靶蛋白的配体，一端连接到E3泛素连接酶，中间有合适的接头。 PROTAC对目标蛋白的降解是通过泛素蛋白酶体系统（UPS）实现的：PROTAC分子与目标蛋白（POI）和E3连接酶结合形成三元复合物，对目标蛋白进行泛素化标记，泛素化蛋白被泛素化酶识别并降解。细胞内蛋白酶体26S。

2022年6月9日，清华大学饶宇教授团队在Nature旗下Signal Transduction and Targeted Therapy杂志上发表了题为“ PROTACs：学术界和工业界的巨大机遇（2020年至2021年更新） “的综述文章，详细介绍了 近两年PROTAC技术的研究进展，总结了PROTAC针对癌症、病毒感染、免疫疾病、神经退行性疾病的代表性新靶点。

PROTACs新靶点研究进展

近20年来，PROTAC领域进入了快速发展期，特别是2015年以Pomalidomide为E3连接酶配体的dBET1 PROTAC成功降解BET蛋白以来，近两年PROTAC相关研究论文不断涌现。经历了爆发式增长。 2019年，饶宇团队总结了40多个据报道被PROTAC降解的蛋白质靶点。近两年新增了约90个可被PROTAC降解的蛋白靶点，涵盖癌症、免疫紊乱、病毒感染、神经退行性疾病等疾病领域，其中癌症是主要应用领域。

图2.近两年PROTAC相关研究的快速发展
（Signal Transduct Target Ther, 7(1): 181.）

据统计，基于PROTAC技术的不同降解剂可降解约54种激酶，占总靶点的45%。激酶已被优选作为蛋白质降解的靶标，主要是因为大多数激酶具有已知且有效的抑制剂或配体，可以轻松修饰以连接接头并保持足够的结合亲和力。此外，激酶具有深层结合袋，可促进 PROTAC 的结合，从而诱导激酶与 E3 连接酶的相互作用，进而泛素化并最终降解激酶。此外，尽管激酶蛋白具有高度同源性，PROTAC 仍可以选择性降解不同激酶亚型。

迄今为止，已发现518种激酶，参与细胞生存、增殖、分化、凋亡、代谢等多种生理调节过程。如下图所示，这些激酶根据其结构和功能可以分为九类，即受体酪氨酸激酶（RTKs）、TKL激酶（TKLs）、STE激酶（STEs）、CAMK激酶（CAMKs）、AGC激酶(AGC)、CMGC 激酶 (CMGC)、非典型蛋白激酶、CK1 激酶 (CK1) 等。其中，红色标记的是人类可降解激酶，具有现有的PROTAC降解剂。受体酪氨酸激酶（RTK）和CMGC激酶（CMGC）的PROTAC降解剂最为发达，分别有19个和14个，占总数的一半以上。相比之下，CK1 激酶 (CK1) 和 CAMK 激酶 (CAMK) 尚未开发出 PROTAC 降解剂。

图 3. 基于 PROTAC 技术的可降解人类激酶及其分类
（Signal Transduct Target Ther, 7(1): 181.）

PROTAC新技术

由于PROTACs是在POI抑制剂的基础上发展起来的，因此仍然存在一定程度的脱靶效应。由于PROTAC的分子量较大，其细胞膜通透性差和药代动力学（PK）特性大大降低了其生物学和治疗效果。此外，有些PROTAC虽然能有效诱导靶蛋白降解，但其生物学作用较弱，对疾病没有有效作用。最后，大多数蛋白质没有相应的小分子缀合物来设计PROTAC，例如在疾病发展中发挥重要作用的转录因子。由于转录因子的抑制剂很少，因此在设计靶向转录因子的PROTAC时没有可用的粘合剂。这极大地限制了PROTAC技术的应用。 为了解决上述问题，近年来出现了不同类型的PROTAC技术，例如抗体-PROTAC、适体-PROTAC缀合物、双靶点PROTAC、叶酸笼式PROTAC和TF-PROTAC。

抗体-PROTAC

Antibody-PROTAC是一种探索新型抗体-PROTAC缀合物与抗体组装的新策略。该技术能够对不同细胞和组织中的蛋白质进行特异性降解，从而优化治疗窗口，减少广谱 PROTAC 的副作用，并增加其作为药物或化学工具的潜力。

适体-PROTAC 缀合物

适配体是具有复杂三维结构的单链核酸，主要包括茎、环、发夹和G4聚合物。它们通过氢键、范德华力、碱基堆积力、静电效应等特殊作用与靶蛋白结合，具有较高的特异性和亲和力，可提高传统PROTAC的水溶性、膜通透性和肿瘤靶向性。

双目标PROTACS

在癌症的发生和发展过程中，通常有多种因素共同作用，包括不同种类的激酶和生长因子，它们可以独立作用，也可以通过信号网络相互干扰。该方法主要是设计一个结合两个或多个药效团的单一分子，同时靶向两个或多个抗肿瘤靶点。

叶酸笼式 PROTAC

叶酸受体 α (FOLR1) 在正常组织中表达较低，但在许多人类癌症中表达较高。叶酸笼式 PROTAC 是另一种提高 PROTAC 靶向特异性的技术。基本原理是将叶酸基团引入PROTAC分子中，实现在靶细胞和组织中的释放。该技术中，叶酸通过细胞内源性水解酶的作用释放出活性PROTAC，然后降解剂诱导目标蛋白的降解。

TF-PROTAC

转录因子（TF）是一类参与基因表达和调控的蛋白质，也是癌症治疗的潜在靶点。与传统激酶不同，转录因子不具有激酶或其他酶中常见的活性口袋或变构调节位点，这使得它们难以被小分子抑制剂靶向。由于TF可以结合特定的DNA序列并调节转录过程，因此理论上可以靶向具有不同DNA序列的TF而不是小分子抑制剂。因此，TF-PROTAC将靶向蛋白的小分子配体替换为相应的DNA序列，从而形成TF-PROTAC，靶向特异性TF，并诱导其降解，从而调节特异性TF的水平和生物学功能。

PROTAC的发展潜力

与其他药物和疗法相比，  PROTACs具有许多潜在的优势，例如广泛的组织分布和口服给药。与其他疗法（如细胞疗法、抗体药物等）相比，PROTAC的生产工艺更为简单。与小分子药物相比，PROTAC可以靶向更多小分子药物无法靶向的靶点，从而产生更好的疗效。因此，PROTAC技术受到业界高度关注，并开始应用于癌症、免疫紊乱、病毒感染、神经退行性疾病等药物研发，其中以癌症领域的应用为主一。

PROTACs作为一项新兴且有前景的技术，在以下方面显示出巨大的发展潜力。

首先，PROTAC 对耐药靶点表现出异常的敏感性。传统上，化疗一直是癌症治疗的主要手段，但化疗药物的获得性耐药性阻碍了临床应用并导致疾病复发。后来开发出激酶抑制剂，免疫疗法也暴露了耐药性的问题。由于PROTAC通过清除整个靶蛋白来影响蛋白功能，包括酶促活性功能和非酶促功能，因此该技术有望解决当前治疗面临的潜在耐药性。

其次，PROTACs有潜力瞄准“不可成药的目标”。大多数小分子药物或大分子抗体需要与酶或受体的活性位点结合才能发挥作用；然而，据估计，人体细胞中 80% 的蛋白质都缺乏这样的位点。 PROTAC 可以通过任何角落和缝隙抓住目标蛋白质。

第三，PROTACs可以影响非酶功能。传统的小分子药物通常通过消除其靶标的酶活性来发挥作用。越来越多的研究表明，PROTACs具有扩大靶点“可成药空间”并控制蛋白酶和非酶功能的潜力。

PROTAC 与其他治疗技术的比较
（来源：信号转导和靶向治疗）

Arivinas由Craig Crews创立，进行 PROTAC技术的药物开发。 近两年， Arivinas公司开发的针对雄激素受体（AR）的PROTAC抑制剂ARV-110和针对雌激素受体（ER）的PROTAC抑制剂ARV-471在前列腺癌和乳腺癌中得到了临床验证，分别是PROTAC技术应用的里程碑。

PROTACs的临床试验研究

除了作为研究工具外，PROTAC 在疾病治疗方面也具有巨大的应用潜力。它已成为一种新的药物发现模式，有潜力将传统药物发现转变为新的重磅疗法。截至2022年3月，如下表所示，全球已有十余种PROTAC药物进入临床开发阶段。其中Arvinas的ARV-110和ARV-471已进入临床II期，是PROTAC药物中临床进展最快的。

表1. 全球临床和IND阶段基于PROTAC技术的蛋白降解候选药物汇总
（Signal Transduct Target Ther, 7(1): 181.）

结论

与其他药物和疗法相比，PROTACs具有许多潜在的优势，例如广泛的组织分布和口服给药。与其他疗法（如细胞疗法、抗体药物等）相比，PROTAC的生产工艺更为简单。与小分子药物相比，PROTAC可以靶向更多小分子药物无法靶向的靶点，从而产生更好的疗效。因此，PROTAC技术受到业界高度关注，并开始应用于癌症、免疫紊乱、病毒感染、神经退行性疾病等药物研发，其中以癌症领域的应用为主一。由克雷格·克鲁斯 (Craig Crews) 创立的阿里维纳斯 (Arivinas) 是第一个推出该药物的公司PROTAC技术的发展。近两年，Arivinas公司开发的针对雄激素受体（AR）的PROTAC抑制剂ARV-110和针对雌激素受体（ER）的PROTAC抑制剂ARV-471在前列腺癌和乳腺癌中得到了临床验证，分别是PROTAC技术应用的里程碑。

尽管PROTAC在过去20年中发展迅速，但仍有许多挑战需要解决。这些挑战主要来自两个方面，即PROTAC分子设计和成药性的优化，以及生物活性的综合评价。第一个是关于 PROTAC 的分子设计和成药性，涉及靶蛋白配体、新的 E3 连接酶配体和新的接头。二是生物活性评价，涉及PROTAC分子的筛选、成药性评价和药理评价。这些问题目前还没有现成的答案，但相信随着更多生物学、药理学和临床研究的发展，新的评价方法和体系将逐步建立来解决这些问题。相信未来会有越来越多的PROTAC进入临床前和临床研究，这将进一步测试PROTACs的治疗效果。预计未来PROTAC技术将为人类疾病治疗和生命健康带来裨益。

PROTAC 开发中常用的接头是 PEG。Biopharma PEG是一家专业的PEG衍生物供应商，提供多功能PEG衍生物作为PROTAC连接体。我们拥有 3000 多种高纯度PEG 连接体库存，为客户的制药和生物技术研发领域的聚乙二醇化、生物共轭、ADC 药物开发提供支持。

几种基于核酸的PROTAC简介

近年来，核酸药物发展迅猛，市场需求不断增加，上市审批迅速，涵盖心血管与代谢疾病、肝病、肿瘤等多个领域。截至目前，全球已有10余种核酸药物获批上市，不少核酸药物正处于临床试验阶段。核酸药物有望成为继小分子药物、抗体药物之后的第三类药物（图1）。

越来越多经批准的核酸疗法证明了通过靶向体内致病基因来治疗疾病的潜力。通常，常规治疗只产生短期治疗效果，因为它们针对的是蛋白质而不是疾病的根源，而核酸药物则直接作用于致病的靶基因或靶mRNA，在基因水平上发挥治疗疾病的作用。核酸药物包括ASO、siRNA、Aptamer、miRNA、mRNA、saRNA、sgRNA、U1 snRNA等。核酸药物具有治疗效率高、毒性低、特异性强、应用领域广泛等优点，显示出其重要的医学价值、生物科学等领域。

PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）是一种利用泛素-蛋白酶体系统（UPS）降解靶蛋白的药物开发技术。从结构上看， PROTAC由三部分组成：E3泛素连接酶配体和靶蛋白配体，两个活性配体通过专门设计的“Linker”结构连接在一起，形成三元复合物。 PROTAC的靶蛋白配体与靶蛋白结合，E3泛素连接酶配体与胞内E3泛素连接酶的底物结合区结合，从而通过泛素化靶蛋白，将靶蛋白“拉”到E3泛素连接酶上，使 UPS 系统能够降解目标蛋白（图 2）。

过去20年来，研究人员基于肽和小分子设计了各种形式的PROTAC。然而，基于肽的PROTAC存在活性低和免疫原性等问题，极大地限制了其临床医学应用。与多肽PROTAC相比，小分子PROTAC体积更小，更容易被人体吸收，成药性更好，因此小分子PROTAC仍然是主流。随着科学技术的发展和进步，一些新型的PROTAC不断出现，基于核酸的PROTAC应运而生。

RNA-PROTAC

RNA 结合蛋白 (RBP) 的功能缺陷是许多疾病的根源，而用常规药物靶向 RBP 已被证明是困难的。 RBP 以动态、协调和序列选择性的方式与 RNA 结合，形成核糖核蛋白 (RNP) 复合物，在 RNA 依赖性中发挥关键作用。某些疾病是由 RBP 的基因变化引起的，影响了 RBP 与 RNA 的结合。

RNA-PROTAC 的新型嵌合结构来靶向 RBP。 2021年，Jonathan Hall研究小组提出基于RNA的PROTACs的设计理念，作者成功构建了靶向 RBP（RNA 结合蛋白）的 RNA-PROTAC。使用小 RNA 模拟物作为靶向基团，它们可以特异性结合 RBP RNA 结合位点。 PROTAC 泛素化 RBP，然后通过泛素蛋白酶体系统降解它们。作者对两种 RBP（干细胞因子 LIN28 和剪接因子 RBFOX1）的降解进行了概念验证，并展示了它们在癌细胞系中的用途。 RNA-PROTACs靶向Lin28蛋白，这是一种干细胞因子和癌蛋白，是多种疾病的潜在药物靶点，具有很高的研究价值。

TF-PROTAC

转录因子（TF）是治疗包括癌症在内的疾病的一类重要治疗靶点。由于TFS缺乏激酶或其他酶中常见的活性或变构位点，传统的小分子抑制剂很难与其结合。因此，转录因子一度被认为是“不可成药”的靶点，存在难以逾越的技术瓶颈。哈佛大学Wenyi Wei教授和西奈山伊坎医学院Jian Jin教授报道了一种基于寡核苷酸链的“ TF-PROTAC “，它由DNA寡核苷酸和E3配体通过点击反应连接而成（图4），并能选择性地降解致病性TF。 TF-PROTAC 的选择性取决于所使用的 DNA 寡核苷酸。

作者成功开发了两个系列的基于VHL的TF-PROTAC：NF-κB-PROTAC（dNF-κB）和E2F-PROTAC（dE2F），分别有效降解细胞内的内源性p65和E2F1蛋白，并表现出优异的抗-细胞增殖作用（图5）。

2021 年，Crews 团队还报道了靶向转录因子 (TF) 的寡核苷酸 PROTAC：oligoTRAFTAC（图 6）。OligoTRAFTAC由与 TF 和 E3 泛素连接酶配体结合的寡核苷酸链组成。

蛋白质印迹实验表明，oligoTRAFTAC 成功降解了两种致癌转录因子：c-Myc 和 brachyury。此外，作者发现oligoTRAFTACs可以成功降解脊索瘤细胞系的brachyury，并且在随后的体内斑马鱼模型实验中也表现出良好的降解活性（图7）。

基于适配体的PROTAC 

适体是寡核苷酸（DNA 或 RNA）序列。寡核苷酸片段通常通过指数富集配体系统进化（SELEX）体外筛选从核酸文库中获得。核酸接头因其可以与多种目标物质以高特异性和选择性结合而被广泛应用。 2021年，谭卫红课题组基于核酸适配体AS1411：ZL216设计了PROTAC（图8）。

AS1411可以特异性靶向肿瘤细胞中高表达的核仁素受体，核仁素受体与其配体结合后被内化。作者通过体外实验证明PROTAC具有较高的水溶性和血清稳定性。此外，作者发现ZL216促进乳腺癌细胞中核仁素受体-ZL216-VHL三元复合物的形成，并在体外和体内有效诱导核仁素受体降解。随后的细胞增殖和迁移实验表明，ZL216还抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移（图9）。

适体-PROTAC 缀合物 (APC)

PROTAC是一种很有前景的靶向蛋白质降解策略。作为一种有效的靶向蛋白质降解方法，PROTACs在催化性能、高选择性、克服耐药性、有效阻断非成药靶点等方面显着优于传统小分子药物。但PROTAC一般具有高分子量和高疏水性，其理化性质很大程度上超过了“五法则”（RO5）。因此，传统PROTAC的药物开发往往受到其细胞膜通透性差、药代动力学（PK）特性差以及缺乏肿瘤特异性靶向的限制。

为此，盛春泉课题组提出了Aptamer-PROTAC Conjugates（APCs）的设计理念。 APC 是通过可裂解的连接链将 PROTAC 靶向 BET 蛋白与适体 AS1411 (AS) 偶联而获得的（图 10）。其中，核酸适体AS1411可以选择性靶向肿瘤细胞表面高表达的核仁素受体。 AS本身对核仁素受体过表达的肿瘤具有良好的抑制活性，目前正在II期临床试验中进行评估。肿瘤细胞中谷胱甘肽含量丰富，因此连接链选择可被谷胱甘肽（GSH）裂解的二硫键，可选择性响应肿瘤微环境，在连接链裂解后释放活性BET降解剂。

图 10. APC 的设计策略

与未修饰的BET PROTAC（PRO）相比，APC缀合物（APR）在McF-7细胞的小鼠异种移植模型中表现出改善的肿瘤靶向能力，从而增强BET蛋白的体内降解和抗肿瘤效力。因此，APC策略为肿瘤特异性靶向PROTAC的开发提供了新的设计思路。

图11 蛋白质降解实验及体内成像、抗肿瘤实验

适配体PROTACs Conjugates (APCs)的发展自提出以来可谓“惊天动地”。与传统PROTAC相比，基于核酸的PROTAC提高了传统小分子PROTAC的靶向性，在提高水溶性、膜通透性、肿瘤靶向性等方面发挥着重要作用。由于核酸药物在体内易被核酸酶水解，半衰期短，极大限制了其在生物医学中的应用。未来的研究方向应集中于提高核酸药物的稳定性、延长半衰期、改善药代动力学性质、解决核酸药物递送问题。 

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