样品实验方案
简要概述
1.将5μl反应缓冲液（组分B）加入目标蛋白（50μl）中
2.将蛋白质溶液添加到ReadiView Biotin SE（组分A）中
3.在室温下孵育30-60分钟
4.通过旋转柱纯化缀合物
溶液配制
1.储备溶液配制
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
ReadiView Biotin SE原液配制：
将10μLDMSO（组分C）加入到ReadiView 生物素SE（组分A）的小瓶中，并剧烈涡旋。
注意：在开始缀合之前，准备ReadiView Biotin SE储备溶液（溶液B）。ReadiView Biotin SE原液的长期储存可能会降低生物素的活性。 溶液B可以在不受潮湿的情况下储存在冰箱中两周。 注意：将ReadiView Biotin SE原液分装到5个样品瓶（2μL/样品瓶）中。 标记100ug蛋白质只需要一个小瓶。 如果您需要重复结合，剩余的小瓶可以在冰箱中保存2周。
2.工作溶液配制
蛋白质工作溶液：
为了标记100μg靶蛋白（假设目标蛋白浓度为2 mg / mL），将5μL（总反应体积的10％）反应缓冲液（组分B）与50μL目标蛋白溶液混合。注意：如果您的蛋白质浓度不同，请相应调整蛋白质体积，使~2 mg蛋白质可用于此标记反应。注意：蛋白质溶液的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，则使用反应缓冲液（组分B）或饱和碳酸氢钠溶液将pH调节至8.0-9.0的范围。注意：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。注意：用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的不纯抗体或抗体可能效果不佳。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，以获得最佳标记结果。注意：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，则结合效率会显着降低。为获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。
操作步骤
1.进行结合反应
1.1将蛋白质工作溶液加入到ReadiView Biotin SE原液（2μL/小瓶）的小瓶中，通过反复移液几次将其充分混合，或者将小瓶涡旋2-5分钟。
1.2将缀合反应混合物在室温下保持30-60分钟。注意：如果需要，可以旋转或摇动缀合反应混合物更长的时间。
2.准备旋转柱进行样品纯化
2.1将提供的旋转柱（组分D）反转几次以重新悬浮沉降的凝胶并除去任何气泡。
2.2取下尖端并将色谱柱放入洗涤管（2 mL，组分E）中。取下盖子，让多余的填料缓冲液通过重力排放到凝胶床的顶部。如果色谱柱没有开始流动，请将盖子推回色谱柱并再次将其取出以开始流动。丢弃排出的缓冲液，然后将色谱柱放回洗涤管中。但是，如果将色谱柱放入12 x 75 mm试管（未提供）中，请立即离心。
2.3在摇动式离心机中以1,000×g离心1分钟（参见“离心注释”部分）以除去包装缓冲液。
2.4向柱中加入1-2 mL 1X PBS（pH 7.2-7.4）。每次施用PBS后，让缓冲液通过重力排出，或将柱离心2分钟以除去缓冲液。丢弃收集管中的缓冲液。重复此过程3-4次。
2.5在摇动式离心机中以1,000×g离心2分钟（参见“离心注意事项”部分）以除去包装缓冲液。
3.纯化缀合物
3.1将色谱柱（从步骤准备旋转柱进行样品纯化）放入干净的收集管（1.5 mL，组分F）中。小心地将样品（20-100μL，来自步骤缀合反应）直接加载到色谱柱中心。
3.2加载样品后，加入1X PBS（pH 7.2-7.4）使总体积为110μL。将柱以1,000xg离心5-6分钟，并收集含有所需生物素标记蛋白的溶液。
蛋白质缀合物的储存
3.3抗体缀合物应在载体蛋白（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5mg / mL储存。当在2mM叠氮化钠存在下储存并且避光时，缀合物溶液可以在4℃下储存两个月而没有显着变化。为了更长时间的储存，可以将蛋白质缀合物冻干或分成单次使用的等分试样并在≤-60℃下储存。
4.离心注意事项
4.1旋转柱（组分D）可以装入2mL微量离心管或12×75mm试管中，用于在离心过程中收集样品。使用2 mL微管和色谱柱进行初始色谱柱平衡步骤。
4.2能够产生1,000 x g的最小力的摆动式离心机适用于Bio-Spin柱。在特定转速下产生的重力是微量离心机转子半径的函数。有关从每分钟转数（RPM）到离心力或g力的转换信息，请参阅摆动式离心机说明手册。或者，使用以下等式计算达到1,000 x g重力所需的RPM速度。
4.3RCF（xg）=（1.12 x 10-5）×（RPM）×2×r（RCF是相对离心力，r是从转子中心到Bio-Spin柱中间测量的以厘米为单位的半径，RPM是转子的速度）。
数据分析
图1.ReadiView 生物素与特殊设计的颜色标签（CT）结合，便于测定生物素化程度。
参考文献
A multifunctional single-attachment-point reagent for controlled protein biotinylation
Authors: Garanger E, Weissleder R, Josephson L.
Journal: Bioconjug Chem (2009): 170
Measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation
Authors: Gabriel L, Stevens Z, Melikian H.
Journal: J Vis Exp. (2009)
Protein C-terminal labeling and biotinylation using synthetic peptide and split-intein
Authors: Volkmann G, Liu XQ.
Journal: PLoS One (2009): e8381
Tandem affinity purification of protein complexes in mouse embryonic stem cells using in vivo biotinylation
Authors: Wang J, Cantor AB, Orkin SH.
Journal: Curr Protoc Stem Cell Biol (2009): Unit1B 5
Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells
Authors: Kim J, Cantor AB, Orkin SH, Wang J.
Journal: Nat Protoc (2009): 506
Analysis of apolipoprotein E nuclear localization using green fluorescent protein and biotinylation approaches
Authors: Kim WS, Elliott DA, Kockx M, Kritharides L, Rye KA, Jans DA, Garner B.
Journal: Biochem J (2008): 701
Chitosan biotinylation and electrodeposition for selective protein assembly
Authors: Shi XW, Liu Y, Lewandowski AT, Wu LQ, Wu HC, Ghodssi R, Rubloff GW, Bentley WE, Payne GF.
Journal: Macromol Biosci (2008): 451
Construction of Nucleic Acid Programmable Protein Arrays (NAPPA) 4: DNA Biotinylation, Precipitation, and Arraying of Samples
Authors: Link AJ, Labaer J.
Journal: CSH Protoc (2008): pdb prot5059
Identification of new accessible tumor antigens in human colon cancer by ex vivo protein biotinylation and comparative mass spectrometry analysis
Authors: Conrotto P, Roesli C, Rybak J, Kischel P, Waltregny D, Neri D, Castronovo V.
Journal: Int J Cancer (2008): 2856
Identification of protein targets of 4-hydroxynonenal using click chemistry for ex vivo biotinylation of azido and alkynyl derivatives
Authors: Vila A, Tallman KA, Jacobs AT, Liebler DC, Porter NA, Marnett LJ.
Journal: Chem Res Toxicol (2008): 432
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货号 |
| ReadiLink 蛋白质生物素偶联试剂盒 |
Cat#5520 |
